生化分离工程实验2011

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1、生化分离工程实验指导老师：何 进 教 授 电子邮箱： 联系电话：13971107550助教学生：赵有文 刘 舒 胡轶敏 危雅乐 1组 李佳佳（组长） 董奇峰 吴婷婷 杨后召2组 范文瑾（组长） 谢贻天 熊雅琪 罗文3组 刘小翠（组长） 张箐 郑琦 孟庆4组 罗云超（组长） 刘浩宇 黄玮 李智5组 唐清（组长） 李斌 严楠峰 柴芝培6组 白腾龙（组长） 伍良伟 余乐 裴媛筠7组 邹铮铮（组长） 刘娟 尹学琳 王海云8组 赵鹏（组长） 张灵芬 潘丽娜 余晓岚菌株的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化E.coli

2、 DH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)检索感兴趣的基因 （hfq/fabz）直 接 优 化 并 合 成 连T载测序重组表达质粒转化E.coli BL21挑取重组子, 用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定-Bradford法目标蛋白的鉴定Western biotting结晶结构解析本次试验内容本次试验的主要内容vHis-Tag系统vpMAL系统无细胞体系目的基因的背景资料vHfqvfabZHfq是一个高度保守 的RNA结合蛋白，最 初被发现是作为大肠 杆菌RNA噬菌体Q 复制所必需的管家因 子。现在则被认为是 细

3、菌基因转录后调控 的关键因子，广泛参 与细菌多种生命活动 的调控。大肠杆菌fabZ基因编 码3-羟基脂酰ACP脱 水酶，是大肠杆菌中 的必须基因，该基因 的突变会导致细菌细 胞的死亡。生化分离工程实验（星期五）一，接种按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养 基中 ,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放 于第八组台面。系统His-Tag系统pMAL系统 菌株编号HAZJH022 宿主菌大肠杆菌BL21大肠杆菌DH5 目的基因hfqfabZ 培养基LB培养基LB培养基 接种量1%（2 ml）1%（2 ml） 加入抗生素Kan（200 ul）Amp（200 ul)生化分离工程实

4、验（星期五）将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200 l于 1.5 ml离心管中，10000 rpm/min离心1 min，弃上 清，加入200 l的无菌水洗涤菌体上残留的培养基 10000 rpm/min离心1 min，弃上清，然后重悬于40 l灭过菌的去离子水中，100 煮15 min， 10000 rpm/min离心1 min，取上清9.2 l作为菌落PCR的 模板。二，菌液PCR （验证目的基因已转入宿主菌中）PCR体系H2O 9.2 l 10 X PCR buffer 2.5 l dNTP 2 .0 l 上游引物 0.5 l 下游引物 0.5 l Taq酶 0.3 l 模板 10

5、l 总体积 25 lPCR程序95 5 min 95 35 s 56 40 s 72 60 s 72 10 min 25 10 minCycle 30注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复， PCR管上做好标记！The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. The pMAL-p2 series of vectors contain the normal m

6、alE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane, and the fusion proteins can be exported to the periplasm表达系统His-TagpMAL菌株HAZJH022培养温度3737转速200 rpm/min200 rpm/min适宜状态OD600=0.6OD600=0.5所需时间2.5 h2.5 h 加入IPTG的终浓 度1.0 mM (2 ml)0.3 mM (0.6 ml)三，诱导注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取

7、1 ml于1.5 ml的离 心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于 第八组桌面的离心管板中，于20 保存。四，配试剂五，PCR结果依据每组发的纸条进行生化分离工程实验（星期五 ）将加入诱导剂后的菌液再放入37 200 rpm/min的摇 床中诱导培养4-5小时后收集菌体。菌株HAZJH022 沉淀 （离心管对应配平 ）8000 rpm/mim 离心5 min8000 rpm/mim 离心5 min收菌弃上清，沉淀用 10ml binding buffer重悬弃上清，沉淀用 10ml column buffer重悬 保存2020注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1 ml于1.5 ml的离

8、心管中，做好标记（ 组号，菌液名）记作“诱导后” 放在第八组的离心管板上。离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！六，收菌组氨酸和Ni-NTAimidazole 亲和作用原理6His/Ni-NTA亲和纯化步骤系统原理示意图pMALNi柱的清洗与保存用水洗3次（去掉保存的20%乙醇） 充电（装满NiSO4，温和摇动后自然沉降 ） 洗涤（3次水洗，去掉游离的Ni)平衡（2次的binding buffer洗）HisTag 蛋白质的纯化步骤上样（每次15ml，样品要与柱子充分结合）加washing buffer（用100%TCA检测不出沉 淀为止）加 Elution buffer （

9、一般收集8ml）重复第48步第 1步：2倍体积 6 M 盐酸胍，0.2 M醋酸 第 2步：2倍体积水 第 3步：1倍体积 2% SDS（注意低温容易析 出） 第 4步：1倍体积 25%乙醇 第 5步：1 倍体积 50%乙醇 第 6步：1 倍体积 75%乙醇 第 7步：5 倍体积 100%乙醇 第 8步：1倍体积 75%乙醇 第 9步：1倍体积 50%乙醇 第 10步：1倍体积 25%乙醇 第 11步：1倍体积水 第 12步：5倍体积 100 mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍体积水 由于 EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同 蛋白时应另换 HisBind 树脂。树

10、脂的再生当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色， 则树脂需要更彻底的清洗处理。直链淀粉柱的再生水3倍柱体积 0.1%SDS3倍柱体积 水1倍柱体积 Column buffer3倍柱体积生化分离工程实验（星期六）一、裂解细胞将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎 至菌液成澄清（ 200-300w超声610s-10s，约 20 min）,天平严格配平后10000*g， 4，离 心20 min。上清取1 ml于1.5 ml离心管中，作标 记为“上清”，沉淀用1 ml对应的buffer（his-tag 为binding buffer，pMAL为column buffer）

11、重悬 后，保存在1.5 ml的离心管中，标记为“沉淀” ，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。二，蛋白纯化系统His-Tag系统pMAL系统柱子类型Ni-NTA柱支链淀粉柱操作方法3次binding buffer平 衡3次column buffer平 衡 堵住下端后上样（ 10ml）静止5 min，盛 接流出液后再上样，重 复三次上样（10 ml）静止 5min，盛接流出液后 再上样，重复三次收集最后一次穿透液， 取1 ml于1.5 ml离心 管中，标记“穿透”收集最后一次穿透液， 取1 ml于1.5 ml离心 管中，标记“穿透” 6次wash buffer水洗Column buffer+1

12、0mM麦芽糖 的溶液洗涤（每加1 ml 用1.5 ml离心管收集) 共收集7管，做好标记Elution buffer洗涤（ 每加1 ml用1.5 ml离 心管收集)共收集7管， 并做好标记系统His-Tag系统pMAL系统操作步骤Elution buffer洗涤2次buffer+10mM麦芽糖 的溶液洗涤2次 加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存后续反应酶切去除标签注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活pMAL系统MBP标签的切除 从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100 l用于蛋白 酶FactorXa的酶解，在100 l洗脱液中取15 ul保存在pcr管 中，作为酶切对照

13、，剩下的加入2 ul的FactorXa后置于摇床 上震荡反应，室温下反应18 h，分别于第1h、3 h、6 h、17 h取样15 l。三，SDSPAGE样品的制备将收集到的14管目的蛋白和之前保存的 “上清 ”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20 ul于 对应的已经标记的1.5 ml离心管中，加入20 ul SDS-PAGE loading buffer ，将先前保 存的“诱导前”“诱导后”（共4管）于 10000rpm/min离心1min，弃上清，沉淀用 15ul对应的buffer重悬，再加入15ul SDS- PAGE loading buffer，沸水浴15 min后， 放于第八组台

14、面。无细胞体系生化分离工程实验（星期六）四，Bradford protein assay1、标准曲线的制作（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成 1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G- 250溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸 ，用蒸馏水稀释至1 L。管号1234567标准蛋 白质（ ml）00.010.020.040.060.080.10蒸馏水 （ml）0.10.090.080.060.040.020考马斯 亮蓝G- 250试 剂（ml ）5555555A595每加完一管立即在漩涡振荡器上混

15、合，25 min后以1号为对照调零测 A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除管号1234567HAZ和 Fabz(ml ）0.050.050.050.050.050.050.05蒸馏水（ ml）0.050.050.050.050.050.050.05考马斯亮 蓝G-250 试剂（ ml）5555555HAZ A595Fabz A595五，未知蛋白浓度的测定将保存的纯化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸馏水后再加入5 ml考马斯 亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止25 min，以0.1 ml水加 5.0 ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。生化分离工程实验（星期六）六， 配制SDS-PAGE试剂分离胶（12%)浓缩胶(5%)ddH2O9.0 ml 5.0 ml 40%丙烯酰