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1、分子流行病学的研究进展及临 床应用陈慧红台州市中心医院概述l定义l分子流行病学研究进展l分子流行病学在医院感染控制中的应用分子流行病学定义分子流行病学是应用先进的实验技术测量 生物学标志，结合流行病学现场研究方法 ，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的 致病过程。传统流行病学l应用血清学方法对血清中各种成分（抗原、抗体、代谢产物、生化物质等）的出现和分布进行研究，阐明疾病及健康状态在人群中的分布及其影响因素，并在采取预防控制措施后应用血清学方法来考核其效果。传统流行病学 暴露 疾病 揭示“黑匣子”秘密分子流行病学传染性疾病 耐药性质粒、病原体变异、新传染病慢性非传染病 证实疾病的病因多病因、多阶
2、段、多基因、长潜隐期人群易感性- 研究个体的发病差异 生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大 ， 传统流行病学无法有效测量分子流行病学的产生分子生物学的快速发展l理论突破 断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶 ，DNA聚合酶等l技术创新 凝胶电泳技术、核酸体外扩增、DNA测序、蛋白质测序、分子杂交等分子流行病学的发展轨迹1972年Kilbone博士美国传染病学会第10次年会上首次提出1982年Perera提出“癌症分子流行病学”1993年美国人Schulte出版了世界上第一本分子流行病学专著，即“分子流行病学”应用分子标志物或生物学测量研究致病因子与所致疾病之间的联系。A 研究方法拓展B 研
3、究范围拓宽分子流行病学和传统流行病学的 关系区别点传统流行病学分子流行病学暴露测量回忆偏倚往往难以避免； 用传统的问卷调查难于解 决暴露随时间变化，或多 途径暴露，符合暴露等。采用生物标志物则可解决 这些问题 暴露测量精确研究对象选择又选择偏倚减少错分集体损害在损害达到相当程度时才 能鉴别出采用生物标志： 可提前发现机体损害 有利于研究低暴露的影响 个体易感性不能测量能测量观察的终点可将观察的终点前移 可增加队列研究终点人数分子流行病学与医院感染控制-细菌同源性分析研究在感 控中的应用手术伤口感染！ 院内感染？导管相关性血流感染！呼吸机相关性肺炎！证据医院感染医院感染是当前医疗卫生的重大问题之
4、一，由于院内感染密切关系到医疗服务质量，关系到病人的预后、病死率、住院时间、床位周转率以及病人和国家的巨额经济损失等。因而，院内感染的控制问题已列为国家乃至世界各国医院管理的重要内容。医院感染的常规检测项目医院感染病例监测医院环境卫生学监测消毒灭菌效果监测医院感染爆发定义指在医疗机构或某科室的患者中短时间内 发生3例以上同种同源感染病例的现象 同一种病原体，药敏一致院内感染控制院内感染的研究中，一个很重要的问题， 就是如何确定感染源和传播途径，只有明 确病原菌的感染方式，才能采取有效的预 防和控制措施。 临床微生物实验室 基础微生物检验学 分子流行病学 方法 院内感染控制 目的 临床诊断 基础
5、17分子分型（分子流行病学研究）从核酸分子水平上分析医院感染的发生、发展规律及机理， 更加准确有效地进行医院感染管理控制，已成为当前国际医 院感染管理研究中的重要方向。 从患者分离株到病区周围环境株的比较分析； 从外源性感染到内源性感染 从某一医院的医院感染暴发到大范围甚至世界 范围的感染菌株流行变迁；基因多态性分析技术已成为医院感染监测控 制的高水平研究领域。微生物室在医院感染中的作用鉴定特殊耐药菌的检出流行病学分型 PFGE 脉冲场凝胶电泳 RAPD 随机扩增DNA多态性 19消化、释放出DNAPFGE原理20Enzyme酶切PFGE原理约520个、长度10 800kb的大片段DNA21脉
6、冲场凝胶电泳(PFGE)制备琼脂糖栓块制备琼脂糖栓块消消 化化酶酶 切切脉冲电泳脉冲电泳结果解释结果解释PFGE原理l电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反 的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快l可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子23脉冲电泳PFGE原理24PFGE结果判读目测法：按美国疾病控制和预防中心(CDC)Tenover等人推荐的方 法判读。图谱完全相同的定为一个型，彼此之间相差一个带的定 为同一型的不同亚型，相差23个带的认为亲缘关系
7、密 切，相差46个带的认为可能相关，条带相差7个以上的 认为无亲缘关系。并随机地选择不同的字母如A、B、C、 D等的字母顺序分型。 聚类分析计算机输入SPSS，做树状图案例一2006年7月，本市某医院外科重症监护病 房（ICU）8例患者下呼吸道感染多重耐药 鲍曼不动杆菌目标性检测对该ICU的环境、医疗用品、医务人员手及 鼻咽拭子进行细菌学监测，共采样107份， 其中23份检出鲍曼不动杆菌，阳性率 21.3%。主要分布在医务人员手、咽部及 床头柜、输液泵、监护仪、治疗车、地面 、病人用物等环境和医疗用品。院感爆发流行的控制空气消毒 15%过氧乙酸铵2g/m3用量进 行蒸熏及臭氧消毒物表消毒 地面
8、、台面0.5%过氧乙酸拖擦 消毒医疗用品消毒 高压蒸汽灭菌 0.5%过氧乙酸浸泡消毒感染患者 隔离治疗 ，分组护理医务人员咽部带菌者 每日2-3次呋喃西林 滴鼻，口泰嗽口案例二2006年我市某院发现了一例携带耐碳青霉 烯肺炎克雷伯菌（痰，血）的患者为了防止该耐药菌在医院内的播散，对该 病区进行目标性监测四株肺炎克雷伯菌的药敏 12 3 4 亚胺培南16161616 厄他培南16161616 头孢西丁=64=64=64=64 头孢匹汚=64=64=64=64 头孢曲松=4=4=4=4 妥布霉素4444 头孢他啶=16=16=16=16 氨曲南 =64=64=64=64 头孢他啶=64=64=64
9、=64 环丙沙星=64=64=64=64 哌拉西林他唑巴坦 =128=128=128=128 左氧氟沙星=64=64=64=64 氨苄西林=32=32=32=32 氨苄西林，舒巴坦 =32=32=32=32 KB(mm） 2163219320852011 多粘菌素B20202120 美罗培南15151515 头孢哌酮 舒巴坦6666耐药菌的基因型分析l1.为阳性对照（KPC-2)l2.肺克（患者痰）l3.肺克（患者血）l4.肺克（隔壁床患者痰）l5.肺克（病房拖把）l6.为阴性对照lMark聚类分析院感及时控制因素l及时发现 l医务人员的重视lICU 环境因素(单房间,单独护理)l环境的消毒措
10、施有效l半年内未出现耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌KPC酶l水解亚胺培南或美罗培南（是目前临床上控制革兰阴性菌感染的最有效的抗菌药物）的一类内酰胺酶l属于功能分类法的2f组，A类，可被克拉维酸抑制，不被乙二胺四乙酸（EDTA）所抑制l现已报道的KPC亚型共12种亚型 l在中国主要见于浙江产KPC酶耐药菌的传播l研究认为，blaKPC位于一种新型的Tn3型的转座子Tn4401上，l其转座子的结构是KPC基因转移的原因l这种新型的转座子结构可以使blaKPC从其原始位置转移至各类不同的质粒l同时认为转座子Tn4401是一个复合转座子，由2次序列插入形成产KPC酶耐药菌l有限的DNA指纹和脉冲凝胶电泳资料显
11、示产KPC酶的肠杆菌科细菌易发生医院感染的暴发流行l最早在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并造成局部地区暴发流行l以后几年再世界各地都有报告脉冲场凝胶电泳（PFGE)l对基因组的DNA酶切片段多态性进行同源性分析，是短期院内感染爆发流行判断的金标准l是一种分离大分子DNA的方法耐碳青酶烯肠杆菌科细菌l2007年下半年零星出现(肺克)l2010年1-8月收集到18株.包括肺克克雷伯菌（15）大肠埃希菌（1）阴沟肠杆菌（1）枸橼酸杆菌（1）产KPC-2肺克同源性分析(2010.1-8)流行病学分析lA型传播源头:患者来自上海某医院，转至我院重症监护室，入院次日做痰培养，检出亚胺培南耐药的肺克。后
12、转入 康复科，耐药菌一直被检测到。A型患者分布于重症监护室，康复科，血液科。lB型和C型的七名患者住我院某外科。B型的五名患者在分离出该耐药菌前未使用过碳青霉烯类抗生素，推测是院内环境感染所致lC型的两名患者，源头的患者住院时间长达121天，在分离出该菌之前，美罗培南使用时间近二十天，推测C型可能是抗生素筛选的结果。 PFGE的局限性l无法判断2006年产KPC酶肺克的小范围流行与2010年出现的15株产KPC酶的肺克A,B,C,三个克隆间有无同源性l不同实验室间的分型结果不能进行比较多位点序列分型 (Multilocus sequence typing,MLSTl一种基于核酸序列测定的细菌分
13、型方法l通过PCR扩增管家基因内部片段l测定其序列，分析菌株的变异MLST的原理l一般测定610个管家基因内部400600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱 ，也即是这株菌的 序列型（sequence type,ST）。这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息 。序列型（ST)l序列型（ Sequence-typying, STs ）等同于MLEE得出的电泳型(Electrophoretic type, ET）l通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同MLST的分析方法lMLST技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩增和测序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值l然后进行等位基因图谱(allelic profile)或序列类型(sequence types, STs)鉴定l再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-wise differences)等方法构建系统树图进行聚类分析谢谢
