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1、疫苗制造基本程序葛俊伟项目一病毒疫苗的制造 项目二细菌性活疫苗制造项目三细菌性灭活疫苗制造内容内容项目一项目一病毒疫苗制造病毒性禽胚培养疫苗制造病毒性细胞培养疫苗制造病毒性动物组织疫苗制造 一、病毒性禽胚培养疫苗制造 受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以 免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和 湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接 毒培养。 痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然 利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、流感疫苗（禽流感疫苗）、犬 瘟热鸡胚弱毒疫苗等
2、。禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单 ，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。（一）鸡胚选择鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获配苗配苗（二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒 两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存， 保存的种毒多为冻干毒。冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定 符合标准后方可作力生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒 价测定和其他项目的检定等。 一、病毒性禽胚培养疫苗制造 种毒与毒种继代种毒与毒种继代鸡胚选择鸡胚选择接毒与收获接
3、毒与收获配苗配苗（三）接毒与收获 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫 苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。接种途径：绒毛尿囊膜接种 1112日龄胚尿囊腔接种 911日龄胚羊膜腔接种 1012日龄胚卵黄囊接种 58日龄胚如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种 0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊 膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。1.接毒一、病毒性禽胚培养疫苗制造 接毒与收获接毒与收获鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标 准与内容物依不
4、同的病毒和不同的疫苗而异。如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.539C、相对湿度 60%70%条件培养增殖，收集接毒后2448h内死亡胚， 置010C冷却424h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿 苗用。也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻 干苗。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48120h内死亡的 鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用 。 2.培养收获按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进 行配苗。1.湿苗通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素5001000U，放置 010C 冷暗处处理后分装。2.冻干苗经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、
5、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加 入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素 5001000U，混合后分装冻干。3.灭活苗收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液， 按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫 苗，放置4-10C保存。（四）配 苗一、病毒性禽胚培养疫苗制造 配苗配苗鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获流程图2病毒性禽胚疫苗制造工艺流程受精卵禽 胚毒 株种 毒灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原 料佐 剂配苗、乳化灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液配 苗活疫苗保护剂分装、冻干分 装灭活原 料种 子扩增 收
6、获配制纯化病毒悬液接种示例甲型H1N1流感疫苗 数据来源：北京科兴生物制品有限公司研制 情况报告全病毒 裂解病毒 亚单位 减毒活病毒（表面抗原）不同疫苗中流感病毒的形态一支甲型流感疫苗自述 前世：致病流感病毒 今生：抗击甲流斗士我是一支甲型流感疫苗。从我开始“孕 育”到“出生”再到拿到合法“户口”大概需要天的 时间，中间要经过各项严格的考验，才能为人类的安 全保驾护航如果把一支甲型流感疫苗 想像成一个新生儿，上述这段话就是它的诞生记。 日上午，记者在位于北京市海淀区的北京科兴生物制 品有限公司的厂房内，全程观摩了甲型流感 疫苗的生产过程。 我的前世：飘荡千年 我的前世，是一个已经在地球上飘荡了
7、千万年的小小病毒 。我是一个直径只有纳米的小小病毒，但是我的 祖先经过不断地变异和重组，繁衍成了一个庞大的家族，分成 很多的亚型。 年月开始，我逐渐出现在人类的视野中。科学 家们开始将我命名为猪流感，后来又更名为新甲型流 感。科学家们把我分离出来后，与一个没有致病性的流感病毒 株放在一起进行繁殖。在这个过程中，我与不断 地重组，科学家从这些重组株中筛选出了一株具有主体 骨架，但同时又有和抗原特性的新毒株。安全性评估 结果表明，重组后的我毒性已大大降低，适合用于疫苗的生产 。于是我从此与家族决裂，并走上了一条对抗流感病毒之路。 我的今生：与家族决裂 要制备大量的流感疫苗，首先必须繁殖大量的流感病
8、毒 。经过近百年的探索，科学家发现我非常适合在鸡胚的尿囊 腔中繁殖。接种机将非常少量的我准确地注入鸡胚的尿囊腔中，然 后一车车的鸡胚被放入无菌、恒温的孵化间，我就悄悄地在 里头快速繁殖着三天过后，我已经繁殖出很多很多的病 毒了。此后，大量的我被合并在一起并转移到灭活间，一种特 殊的灭活剂被加入到容器中，在不断搅拌的过程中我慢慢失 去了知觉，沉沉睡去大约一周过后，我从噩梦中惊醒， 却赫然发现自己已经完全失去了活性，无法使人致病也无法 繁殖和生长了！在纯化区域的多个小屋子里，我多次穿过一些特 殊的筛子、管道，并被放在高速离心机中旋转了很久 ，我逐渐被浓缩，而那些灭活剂和鸡蛋中的杂质等就 被陆续去除
9、掉了。期间工作人员还往我身边加入了一 种叫做裂解剂的特殊物质，使我由一个完整的病毒分 开成碎片，我身上的核酸和一些可能会引起人体不良 反应的大分子蛋白以及裂解剂经进一步的纯化被去除 ，主要保留了能引起人体免疫反应的表面抗原有效成 分和部分的内部抗原蛋白。在除菌过滤过后，我就有 了一个新的身份：病毒原液。接下来我被按照一定的 比例用注射用水进行稀释，并加入适量的盐分，形成 了疫苗半成品 不过我要变成可以供人类直接使用的疫苗还要经 过非常严格的分装和包装程序。由于我比较脆弱， 需要在的温度下避光保存。接下来的两 三周时间里，我还要经过两道考核关：生产厂家和 中国药品生物制品检定所会随机抽取一部分已
10、经完 成全部包装的我再进行严格的体检。通过企业自检 和国家复检后，中国药品生物制品检定所才会给每 一批疫苗颁发一个合格证书，也就是说只有这个时 候我才真正获得了我的合法“户口”，马上就可以投 入到抗击流感的战斗中去啦。 二、病毒性细胞培养疫苗制造用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无 菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门 检定分发。领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种， 制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种， 或为冻干毒种。 细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以 强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造
11、程序 既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细 胞及细胞培养方法也有所不同（一）种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据 病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。选择的依据包括：病毒的适应性高、毒价高、细胞来源方 便、制备简单、生命力强。如脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适 应疫苗采取BHK21细胞增殖病毒猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞疫 苗采用犊牛睾丸原代细胞；等。（三）细胞制备 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备二、病毒性细
12、胞培养疫苗制造培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的 生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有 5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和 悬浮培养在我国尚处于试验之中。 （四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时 或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小 病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎 细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%- 2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进
13、行培养，待出现 70%-85%以上细胞病变时即可收获。病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养 瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取 ；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无 菌检验、毒价测定合格后供配苗用。 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造（五）配 苗 1灭活疫苗不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按 规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭 活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入 佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。2冻干苗细胞毒液内按比例加入保
14、护剂或稳定剂，充分混合、分 装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造流程图3病毒性细胞疫苗制造工艺流程动物或胚胎组 织毒 株种 毒灭活病毒消化鉴定培育培养检验检验配制原 料佐 剂传代细胞配 苗 （混匀、乳化）灭活疫苗细胞悬液生长细胞配 苗活疫苗保护剂原 苗分装、冻干分 装灭活原 料原 料细胞培养液配制剪碎种 子鉴定扩增收获 配制 灭菌三、病毒性动物组织疫苗制造 病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病 毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗 称为组织疫苗(t
15、issue vaccine)。动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者 多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以 弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力 有着决定性的作用，动物必须符合下列标准：(1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性 病原体动物；(2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面 合乎要求的实验动物。 （一）动物选择观察与收获观察与收获动物选择动物选择配苗配苗种毒与接种种毒与接种种毒既可用抗原性优良、致死力强的
16、自然毒株脏器组织毒或强毒株增 殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和 免疫原性检查合格后使用。接种途径依病毒性质和目的而异，例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注 射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗 ，用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。几种动物常用的接种途径如下：1. 脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。2. 静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。3. 肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。4. 皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。5. 腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。 （二）种毒与接种三、病毒性动物组织疫苗制造 观察与收获观察与收获动物选择动物选择配苗配苗种毒与接种种毒与接种动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因 不
