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1、制备针对某种肿瘤抗原并应用 于临床治疗的人源化抗体4月刊自然综述癌症（Nature. Reviews. Cancer. ）“Antibody therapy of cancer”http:/ 导导导导凋亡凋亡凋亡凋亡呈呈呈呈递药递药递药递药 物或物或物或物或细细细细胞毒胞毒胞毒胞毒 性性性性剂剂剂剂毒害毒害毒害毒害肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤 调调理吞噬理吞噬 ADCCADCC 经经典途径激活典途径激活补补体体介介导导免疫免疫杀伤杀伤破坏破坏肿肿肿肿瘤瘤组织组织组织组织 特异性毒特异性毒杀杀 肿肿瘤血管和基瘤血管和基 质质抗体在杀伤肿瘤中的作用抗体的直接作用抗体的直接作用结结合相合相应应受体受体 ，阻断或
2、激活相，阻断或激活相 应应反反应应，诱导诱导 凋亡凋亡呈呈递药递药 物或物或 细细胞毒性胞毒性剂剂 毒害毒害肿肿瘤瘤介介导导免疫免疫杀伤杀伤调调理吞理吞 噬噬ADCCADCC经经典途典途 径激活径激活 补补体体破坏破坏肿肿瘤瘤组织组织特异性毒特异性毒 杀肿杀肿 瘤血瘤血 管和基管和基质质治疗性单抗识别的肿瘤相关抗原分类造血细胞造血细胞 分化抗原分化抗原细胞表面分化细胞表面分化 抗原（糖脂、抗原（糖脂、 糖蛋白、碳水糖蛋白、碳水 化合物）化合物）参与生长和参与生长和 分化信号的分化信号的 抗原抗原作为治疗靶标作为治疗靶标 的间质和细胞的间质和细胞 外基质抗原外基质抗原参与血管生参与血管生 成的抗
3、原成的抗原自1997年至今，共有12 种抗体获得了FDA【美 国食品药品管理局 】 的批准用于治疗各种实 体瘤和血液系统恶性肿 瘤寻找靶向抗原基本要求用于用于用于用于肿肿肿肿瘤治瘤治瘤治瘤治疗疗疗疗的抗体安全性和的抗体安全性和的抗体安全性和的抗体安全性和疗疗疗疗效各不相同效各不相同效各不相同效各不相同 ，主要取决于靶向抗原的特性。，主要取决于靶向抗原的特性。，主要取决于靶向抗原的特性。，主要取决于靶向抗原的特性。理想的靶抗原，理想的靶抗原，理想的靶抗原，理想的靶抗原，应该应该应该应该 数量丰富，易于数量丰富，易于数量丰富，易于数量丰富，易于获获获获取，取，取，取， 均一、一致及独特地表达于癌均
4、一、一致及独特地表达于癌均一、一致及独特地表达于癌均一、一致及独特地表达于癌细细细细胞表面。胞表面。胞表面。胞表面。抗原分泌抗原分泌抗原分泌抗原分泌应应应应最少，因最少，因最少，因最少，因为为为为分泌抗原会分泌抗原会分泌抗原会分泌抗原会结结结结合血液合血液合血液合血液 循循循循环环环环中的抗体，阻碍足中的抗体，阻碍足中的抗体，阻碍足中的抗体，阻碍足够够够够的抗体的抗体的抗体的抗体结结结结合合合合肿肿肿肿 瘤。瘤。瘤。瘤。寻找靶向抗原不同功能 为为了免疫效应细应细 胞和补补体能最大限度利用 抗体Fc域，理想的靶抗原抗体复合物必须须 不会被迅速内化，否则则来不及发挥发挥 效应应ADCC、CDC、调
5、调理吞噬 靶抗原具有良好的内化功能则则最为为理想递递呈毒素或药药物应对肿应对肿 瘤的免疫逃逸寻找靶向抗原应对逃逸机制 肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞表胞表胞表胞表 面低表达面低表达面低表达面低表达 MHC-IMHC-IMHC-IMHC-I分子，分子，分子，分子， CTLCTLCTLCTL无法无法无法无法识别识别识别识别 杀伤杀伤杀伤杀伤双特异性抗双特异性抗双特异性抗双特异性抗 体体体体肿肿肿肿瘤低表达共瘤低表达共瘤低表达共瘤低表达共 刺激分子受体刺激分子受体刺激分子受体刺激分子受体 ，无法，无法，无法，无法为为为为T T T T细细细细胞胞胞胞 提供第二信号提供第二信号提供第二信号提供第二信号寻寻
6、寻寻找有效的靶找有效的靶找有效的靶找有效的靶 抗原，抗原，抗原，抗原，设计设计设计设计 scFvscFvscFvscFv，对对对对TCRTCRTCRTCR进进进进 行特异性行特异性行特异性行特异性基因基因基因基因 修修修修饰饰饰饰 肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞表达胞表达胞表达胞表达FasLFasLFasLFasL，而淋巴，而淋巴，而淋巴，而淋巴细细细细胞表达胞表达胞表达胞表达 FasFasFasFas，接触后会，接触后会，接触后会，接触后会诱导诱导诱导诱导 淋巴淋巴淋巴淋巴细细细细胞凋亡胞凋亡胞凋亡胞凋亡借助有效的靶向机制向借助有效的靶向机制向借助有效的靶向机制向借助有效的靶向机制向肿肿肿肿瘤瘤
7、瘤瘤细细细细胞胞胞胞导导导导入入入入FasLmRNAFasLmRNAFasLmRNAFasLmRNA互互互互补链补链补链补链 ，阻止，阻止，阻止，阻止FasLFasLFasLFasL转录转录转录转录 后表达；后表达；后表达；后表达；设计对肿设计对肿设计对肿设计对肿 瘤瘤瘤瘤细细细细胞有特异性的胞有特异性的胞有特异性的胞有特异性的 FasFasFasFas抗体，使抗体，使抗体，使抗体，使FasFasFasFas单单单单抗特异性与抗特异性与抗特异性与抗特异性与肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞的胞的胞的胞的FasFasFasFas结结结结合，合，合，合，诱诱诱诱 导导导导凋亡凋亡凋亡凋亡为什么要制备人源化
8、抗体？为什么要制备人源化抗体？鼠源单克隆抗体神奇的子弹 单克隆抗体的若干缺陷单克隆抗体的若干缺陷人抗鼠抗体 Human antigen mouse antibody （ HAMA） 不能有效激活人体中补体和受体相关的效应系 统 体内半衰期较短 人源化抗体优点人源化抗体优点 减少降低了机体的免疫排斥反应 募集效应因子或效应细胞 在体内的半衰期长 对于该现象的解释是：人源化抗体中的Fc段可以特异结合人血管 内皮细胞上的Fc受体（FcRn)，使抗体内化到血管内皮细胞而不被降解， 并能够回到血液中参与循环。鼠抗体由于不能有效的与人FcRn结合而很快 从循环系统中清除。抗体人源化的基本原则抗体人源化的基
9、本原则 保持或提高抗体的亲和力和特异性 大大降低或基本消除抗体的免疫原性 所以，构建人源化抗体的关键在于选择合适的人抗体轻链和重链作为鼠 cDRs的框架区。 鼠单抗人源化鼠单抗人源化 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠 体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大 量完全人源化抗体 恒定区人源化恒定区人源化人人- -鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 可变区人源化可变区人源化人改型抗体人改型抗体 用抗体库技术进行人源化用抗体库技术进行人源化鼠单抗人源化鼠单抗人源化鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图表面氨基酸残基人源化方法步骤 获得鼠源单抗重轻链可变区基因 可变区基因定点突变 构建人鼠嵌合基因
10、构建真核表达系统1.获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段肿瘤抗原免疫小鼠取小鼠脾细胞（含B细胞）骨髓瘤细胞杂交瘤细胞株分别获得抗体VH、VL基因PEGRT-PCR设计引物参照发表的该鼠源单抗重 轻链可变区基因2.重轻链可变区基因片段分别连接克隆载体获得的两个可变区基因酶切、连接克隆载体转化原核表达系统检测抽质粒、测序鉴定第一代人源化抗体：人鼠嵌合抗体CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体人源化抗体在选择人 FR 时一般有两条途径：起初的一条是，根据已有晶体结构数据的人源抗体的可变区框架，借助 序列比较与分子模建确定在人、 鼠间的种源差异，由其是鼠 FR 中与 CDR 有 密切作用 的氨基酸残基，要保留在替换的人源 FR 中。第二条途径是，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠单克隆抗体FR 有最大同 源性的人源 FR 用以替换。在选择同源的人 FR 时,先前倡导将 VL 和 VH 作 为一个整 体来考虑,寻找最高同源的人 FR。 后来则认为 ,将 VL 和 VH 分开 考虑,分别寻找最高同源的对应序列3.鼠源可变区编码基因进行PCR定点突变 根据突变位点设计引物 进行多轮突变，获得重塑的鼠源可变区基因 质粒转化大肠杆菌，培养 测序鉴定4.构建真核表达系统l 基因片段 插入含有 人IgG重轻 链恒定区 的表达载 体 l转染酵母 l产生抗体
