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1、第二节 沙门菌检查法n美国细菌学家Salmon与Smith于1885年分离出猪霍乱 沙门菌。1990年为纪念Salmon，定名这类细菌为沙 门菌属。n沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌。包括伤寒、副伤 寒甲、乙、丙型，肠炎，鼠伤寒等沙门菌，现今已 发现2324个血清型。n在世界各地的食物中毒中，沙门菌食物中毒常占首 位或第二位。规定在药品和食品中不得检出沙门菌 。美国每年报道病例45 000个左右，实际数量可能 多达200-300万。伤寒每年400-500例。一、生物学特性1.形态两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，（0.4-0.9）m (1-3)m，无芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少数有包膜。光滑型的细菌大小
2、均匀，粗糙型则大小不一，长短不一。2. 培养特性n在营养琼脂平板上18-24h培养形成无色半透明，表 面光滑、湿润、隆起的菌落，直径2-3mm。有些菌株 在营养琼脂平板上生长不良，形成 “侏儒”菌落， 加葡萄糖或甘油，生长良好，但易使菌株粗糙, 呈 干燥、无光泽、边缘不整齐。n光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀；粗糙型则产生 沉淀，上层液透明。n生长温度在10-42，最适38；pH4.5-9，最适 pH6.8-7.8；需氧或兼性厌氧。3. 生化特性n靛基质-，甲基红+，v-p -，柠檬酸盐反 应d，产硫化氢，尿素酶反应-，还原硝 酸盐， -葡萄糖醛酸苷酶d，不能发酵 乳糖，可以被噬菌体裂解。4.
3、抗原结构（1）抗原构造n菌体抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破 坏。与特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢， 不易摇散。现已知有50多种，多数沙门菌含有 两种以上的O抗原，有的O抗原是一种菌独有的 ，有的是几种菌共有的，凡含有共同特异性抗 原成分的血清型归为一个群，可将沙门菌化分 为42群，按A-Z排列，Z以后的顺序以O51-O67表 示。引起人类沙门菌病的95%以上都在A-F 6个 群内。n表面抗原（K抗原）：沙门菌中有三种K抗原， 即Vi抗原、M抗原和5抗原。q可阻止O抗原被抗O血清所凝集，具有O不凝集 性。常用于菌型鉴定。qM抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊意义 。q5抗原：n鞭毛抗
4、原（H抗原）：经乙醇或酸 处理后失去与特异性抗体的结合 力。制备时，应用具有丰满鞭毛 的菌种18-24h的培养物，加甲醛 固定或60以下加热后即成H抗原 。H抗原与抗H血清562h后，可 出现疏松易于摇散的絮状凝集。沙门菌的H抗原有两相，特异性高的 称为第1相（特异相）抗原；特异性低的 称为第2相（非特异相）抗原；多数沙门 菌同一菌株，常可分离出两种H抗原的菌 落，菌落的外观性状完全一样，但与相 应抗体作凝集反应时则明显不同。具有 两相抗原的称为双相菌，仅有一相抗原 的则称为单相菌。（2）抗原变异nSmooth-Transient-Rough变异：为避免R型的出现， 保存培养基内不应含有糖类，
5、不要多次移种传代。nV-W（Vi-O）变异：具有Vi抗原的菌株称为V型菌， 失去Vi抗原的菌株称为W型菌。W型菌只能同其相应 的O型血清发生凝集，而不与Vi血清凝集。nHO-O变异：有鞭毛抗原的HO型菌变为无鞭毛的O型菌 。n位相变异：有双相鞭毛抗原的沙门菌两个相可以互 变。通常在一个培养物内二相并存，在平板上各占 半数，但挑取单菌落，经多次移接后，又出现两相 各半现象，这种由一相变为另一相的变异，称为位 相变异，单相菌不产生位相变异。5、 发病机理和症状n菌量大n活菌和菌体内毒素协同作用n小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜 ，由淋巴 系统进入血液n潜伏期8-48hn急性期，每克粪便中沙门菌多至10亿
6、个食物中毒的特征性症状n腹泻n恶心n腹痛n低烧和寒颤n有时呕吐、头痛、倦怠伤寒的典型症状n持续发热39-40n昏睡症n剧烈腹痛（腹部痉挛）n头痛n食欲不振n出现扁平的玫瑰红色点状 红疹（一） 检验程序供试品供试液预增菌增菌DHL S.SEMBMaCCTSI（三糖铁琼脂）氰化钾 赖氨酸脱羧酶试验 尿素酶试验 吲哚试验 血清学试验 半固体营养琼脂 革兰染色、镜检报 告二、沙门菌常规检查法1.预增菌:u将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养， 使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌 培养基中。u一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用 乳糖肉汤作预增菌液。以1：10的比例接种， 18-24h,35
7、-37。预增菌培养基的选择培养基商品 缓缓冲蛋白胨胨水（BPW）使用于所有商品BPW+酪蛋白巧克力乳糖肉汤汤蛋和蛋制品，火腿，pH6的着 色食品 乳糖肉汤汤+表面活性剂剂7或曲拉通X -100椰肉，肉，干燥或加工过过的动动 物食品 乳糖肉汤汤+ 0.5%凝胶酶凝胶脱脂乳+亮绿绿巧克力，糖，糖衣胰蛋白胨胨大豆肉汤汤香料、香草、干酵母胰蛋白胨胨大豆肉汤汤+ 0.5%硫酸钾钾洋葱和蒜粉等水+亮绿绿奶粉2.选择性增菌n取1mL预增菌液转种至增菌培养基10mL。 3724h，培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸 肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养 基，我国与英国相同采用后者。美、日 采用二者联用有助于提高沙门菌的
8、检出 率。转接到选择性 培养基免疫 磁性分离技术（Immunomagnetic separation，IMS）3.分离培养选择性培养基：nDHL：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色 或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色nHE：蓝绿或蓝色，产硫化氢的菌落中心黑色 或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色nSS：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色 或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色n分离沙门菌应以出现单个菌落为准，否则应重 新分离。n由于平板用前未烘干，或因分离不良菌落连片 均须重新分离。n致病菌菌落一般在经3624h培养后，再放置 室温2-3天后不发生变化，而非致病菌则继续 增生、增厚，并带黄灰色，
9、并产生臭味。n对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍(1)初步鉴别试验：三糖铁琼脂|乳糖:蔗糖:葡萄糖=10 : 10 : 1|以酚红作指示剂|当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄色 ；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白胨而 释放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色|细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生 成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化 亚铁。4.生化试验斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色，无黑色斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可 出现上述反应
10、。n 吲哚试验：阴性n志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产 生H2S。n大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生 H2S 。n沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生H2S ，多数产气。n下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？赖氨酸脱羧酶试验纯培养菌落赖氨酸脱羧酶 产酸含糖蛋白胨培养基溴甲酚紫产碱(尸胺) CO2 对照为黄色,阳性为紫色 培养时间不超过四天 伤寒和鸡沙门菌除外，均为 阳性含糖蛋白胨培养基紫色(3)尿素酶试验n区别变形杆菌n具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿 素，产生氨，培养基碱性，使酚红变 红。沙门菌反应阴性
11、注意：用无尿素的培养基作对照 (4)氰化钾试验n沙门菌、志贺菌和埃希菌的 生长受KCN抑制。nKCN 浓度为1：13300或1： 10000。n沙门菌此反应阴性。待检菌新鲜培养物KCN培养基3648h 不生长铁卟啉呼吸酶失活注意：u氰化钾的浓度u控制接种量u试管封口严密u操作谨慎u用后的培养管加硫酸亚铁和 氢氧化钾去毒u对照不加 KCN（5）动力检查l沙门菌周生鞭毛，能运动。l猪霍乱沙门氏菌（S.gallinarum）和鸡白痢沙门氏 菌（ S.pullorum）没有运动性5.血清学凝集试验（1）沙门菌属诊断血清 诊断血清规格： 10种1套：主要供伤寒、副伤寒沙门菌初步 诊断用。包括Vi及A-F
12、群多价血清各1种 ；O因子血清4种；H 因子血清4种 26种1套：主要供沙门菌常见菌型定群和初 步定型用。包括Vi及A-F群多价血清各1 种；O因子血清9种；H 因子血清15种57种1套：主要供沙门菌常见菌型定型用。 包括Vi及A-F群多价血清各1种；O因子血 清16种； O复合因子血清各1种；H 因子 血清31种； H复合因子血清3种 144种全套：供各型沙门菌诊断用。包括诊 断各型沙门菌用的各种多价O、多价H血 清和单因子及复合因子血清群别别菌种名称O抗原成分A甲型副伤伤寒杜雷佐变变种(S. para Typhi A)2,12B里丁沙门门菌(S. reading)4,12C1猪霍乱沙门门菌
13、1350(S. cholerae-suis)6,7C2新港(纽纽波特)沙门门菌(S. newport)6,8D1伤伤寒沙门门菌0901(S. typhi)9,12E伦伦敦沙门门菌(S. London)3,10F阿伯丁沙门门菌 (S. aberdeen)11A-F群O多价血清的代表菌株n根据沙门菌菌型调查结果，95%以上的沙门菌都属于A-F六 个O群，常见菌型不过20个左右，因此沙门菌检验，主要是 对A-F群沙门菌做出初步鉴定。按常规方法选用A-F群多价O 血清。凝集试验方法n二者比例适当，菌量过多过 少均不易观察到正确结果。n 阳性反应通常在3min内发生 。n血清效价低反应迟缓时，应 将玻片
14、置培养皿内，放一个 湿棉球，盖上皿盖，经约 20min再观察结果。n出现凝集现象的待检菌培养 物，应以灭菌的生理盐水溶 液代替A-F多价O血清，与培 养物混匀做对照试验，对照 应无凝集现象，方可判为阳 性反应。A-F多价O血清稀释接种环沾取2-3环1.5cm0.5cm条形涂抹待检菌 36 18-24h接种环刮取少许混匀待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称 自家凝集现象，这种现象多为S-R所致。当A-F多价O血清凝集试验为阴性时，还 应当考虑是否因为待检菌含有Vi抗原所致。3、结果判断及报告（1）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价 O血清凝集试验阳性反应，做出供试品检出沙门菌 报告。 （
15、2）生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多 价O血清凝集试验阴性反应，做出供试品未检出沙 门菌报告。 （3）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价 O血清凝集试验阴性反应；或生化试验不符合沙门 菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阳性 反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。n对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待 检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生 化试验。糖醇发酵试验明胶液化试验硝酸盐还原试验甲基红试验VP试验柠檬酸盐利用试验半乳糖苷酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验丙二酸钠试验有机酸盐利用试验甘油品红试验明胶液化试验被胶原酶分解判断结果前，冰箱冷却。明胶的用量与质量肠杆菌科一
16、般为阴性反应假单胞菌一般为阳性硝酸盐还原试验待检菌硝酸盐琼脂斜面30s培养物-萘胺1mL对氨基苯磺酸1mL阳性3618-24h阴性亚硝酸盐存在u硝酸盐没有被还原（真阴性反应）u假阴性结果:硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产物 ，如NH3、N2、NO或N2O和羟胺。u需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸 盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余 的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。u肠杆菌科细菌皆为阳性反应苯丙氨酸脱氨酶试验待检菌新鲜培养物10%三氯化铁 4-5滴苯丙氨酸琼脂培养基3618-24h苯丙酮酸阳性苯丙氨酸脱氨酶接种培养物要多避免假阴性立即观察，5min之内变形杆菌阳性，肠杆菌科阴性半乳糖苷酶试验待检菌新鲜培养物制成浓菌液36 5min振摇使酶释放阳性生理盐水甲苯1滴ONPG0.25ml37 20min、3h、18h、24huONPG=邻硝基酚-D半乳糖苷u阴性反应不变色uONPG为无色upH7.0，过酸假阴性，过碱假阳 性甘油品红试验待检菌新鲜培
