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1、第九章基因工程与基因组学第一节 基因工程 概念：利用DNA重组技术，把一个细胞中的基 因转移到另一个细胞中，并使该基因控制的性 状能够正确表达，这项技术称基因工程（gene engineering).细菌的接合：1.原理： 噬菌体转导U形（戴维斯）管实验： 1950年，Davis,B设计， A: trp- his+ B: trp+ his- 混合培养后，10-7细胞得到100个trp+ his+ 。没有接合，怎么而来？研究结果： 是一种温和型噬菌体（P22）携带的结果。 噬菌体：称可过滤因子。 概念：以噬菌体为媒介，把一个细菌的基因导 入另一细菌，这一过程称转导（transduction).烈
2、性噬菌体：T2, T4 温和型噬菌体： , P1, P22亮氨酸转导这就是天然基因工程（基因转 移）过程!2. 几个概念： 供体（donor)：品系甲，提供基因； 受体（recepter)：品系乙，接受基因； 目的基因（target gene)：被转移的基因，亮氨 酸； 载体(vecter)：噬菌体，携带基因；DNA重组（recombination)：噬菌体插入大肠 杆菌的过程，目的基因与载体结合；几个概念2 限制性内切核酸酶（restriction endonucleases) 和连接酶：DNA切开与连接； 感染（infection)： 载体进入受体的一种方式； 转化、转导等。 基因繁殖且表
3、达。3. 基因工程的主要步骤： . 目的基因获得： 物理分离法； 化学合成法； 酶切（鸟枪射击）法； 逆转录法； 噬菌体摄取法； 基因组克隆法等. 载体与DNA重组 合适载体；质粒、噬菌体、转座子等 限制性内切酶； 连接酶；重组1重组2内切酶 把重组DNA分子送入受体： 转化： 转导； 基因枪 注射； 其它一切介导方法。转化注射电激基因枪脂质体示意图脂质体4. 基因工程的成就： 1.三大支柱：干扰素、人的脑激素、胰岛素 2. 人的抗凝血因子转到羊身上； 3. 抗虫：Bt基因、胰蛋白酶基因、 4. 抗病：抗病毒基因5. 基因工程要做些什么？ 1. 固N； 2. 大豆蛋白基因转到水稻中； 3. 动
4、物蛋白基因转到植物中； 4. 疫苗抗原转到植物中； 5. 新的抗病虫基因转到新品种上； 6. 大象的生长基因转到猪身上； 7. 观赏新类型；等等第二节 基因组学 概念：研究生物体全基因组的分子结构和遗传 功能的学科称基因组学（genomics)。 结构基因组学（structural genomics)：以分析 测定基因组核苷酸序列为主要目的的基因组研 究； 功能基因组学（functional genomics)：研究全 基因组的基因及其功能，又叫后基因组学（ post-genomics)。基因组计划（genome project)： 研究一个基因组的全部工作的规划： 1.测定全部DNA序列；
5、2.构建基因组的物理图谱； 3.构建基因组的遗传图谱； 4.构建基因组的转录图谱； 5.分析基因组的功能。目前实施的基因组计划：微生物：大肠杆菌、噬菌体、酵母 植物：拟南芥、水稻； 动物：果蝇、猪、牛、鸡等；人。例：人类基因组计划（HGP, human genome project） 1986.3.7 美国一个叫dulbecco在Science 上发表一篇文 章：“肿瘤研究的一个转折点：人类基因组的全序列分 析”。人有310 9 bp，工作是浩瀚的。 1990年，美国国立卫生院对“人类基因组计划”立项， 拨款30亿美元。 2000年，完成人的基因组草图，完成结构基因组学。 2005年，完成功能
6、基因组学。HGP的目标 1. Generate sets of full-length cDNA clones and sequences that represent human genes and model organisms. （分析出代表人类全部基因和模式生物的 全长cDNA克隆和序列）。 2. Support research on methods for studying functions of nonprotein-coding sequences（产生一 种方法用来研究非蛋白编码序列的功能）。 3. Develop technology for comprehensive
7、analysis of gene expression（研究一些技术用来理解和分析基 因的表达）。4. Improve methods for genome-wide mutagenesis（ 研究一些技术用来研究整个基因组的突变产生）。 5. Develop technology for large-scale protein analyses. 研究蛋白质大规模分析技术。显微镜下人的染色体人的染色体组HGP与中国 1998年8月11日，中科院遗传所“人类基因 组中心”成立。1999年2月，中心决定进行大规模基因组测 序，以创造加入“国际测序俱乐部”的条件。 同年7月7日，中国在国际人类基因
8、组测序协作 组登记，申请加入“国际测序俱乐部”。 并承担了1%的染色体测序任务。中国的基因组工作室我国的工作人员正在测序HGP实验室（图）中国基因组人员在工作一、建立DNA（cDNA)文库 创造人的46个染色体的DNA文库，该DNA是工 作的材料。测序可能要做若干次重复，因此， 要有一定数量的DNA做原料，即，可克隆的 DNA片段（clonable Fragmant）。 DNA文库有cDNA（complementary DNA）文 库和gDNA(genome DNA)文库两种。1. 取材 选取的原始个体不同，DNA文库的基因序列， DNA序列肯定不同。白种人、黄种人、黑种人 、不同地区的人，选
9、什么人，研究者有他们的 想法，可能是科学家，也可能是他们自己，更 可能是随机取样；2.文库的建立 DNA文库技术 RH（Radiation Hybrid） YAC(yeast Artificial chromosome) BAC(Bacterial Artificial chromosome) PAC,cosmid,fosmid等.RH （Radiation Hybrid）方法 将人的细胞（染色体）用X-光照射打断染色体，该细胞与鼠细胞融合，使DNA片段能插入到鼠的染色体上，扩增的细胞株中的人DNA片段(5-10Mb),得到克隆（也有STS出现），用作分析。YAC（Yeast Artifici
10、al chromosome）方法 利用酵母染色体结构和复制系统（着丝点、端 粒、复制子）来复制人的DNA分子；可克隆 2002000kb的DNA； 特点：克隆片段大，可达Mb级别，用作自动 分析材料。pYACBAC（Bacterial Artificial Chromosome ）： 把人的染色体片段嵌入细菌的质粒（F质粒） 中，可运载扩增100300kb DNA。 特点：较小，便于普通测序。但自动测序时显 得小。PAC文库 PAC(P1-derived Artificial chromosome）是P1 噬菌体为载体的DNA文库。可以看出，PAC肯 定较小，携带90-150kb 的DNA。L
11、oannou将 PAC用于人基因组，构建了12万个插入片段， 长度为110-120kb，容量是人基因组的3倍。 1200001101000=1.321010/（3109）=4.4倍 ，保守即约为3倍。TAC 文库TAC(Transformation-competent Artificial chromosome)叫可转化人工染色体。载体是pYLTAC7(p1质粒和Ri质粒），可用于 植物。HAC文库 HAC(Human Artificial chromosome)叫人类人 工染色体。二、DNA序列测定原理 将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱 基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1.
12、化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应 和C反应； 2.Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 3.自动测序法1. Sanger 的测序方法 CGCTCAGC TGGTGATT GTGTSanger2.连续测序法 一轮 随机引物 二轮 测出的序列 作为二轮的引物 三轮 测出的序列 作为三轮的引物三、测序-及连接方法的遴选 对文库中的各片段逐一测序，测序后的连接则是一个 巨大的任务（生物信息学）。目前有两种思路： 1. 第一种是全基因组散弹法（whole genome shut-gun) ：即从文库中随机取，然后分析，分析后再根据碱基 序列进行拼接，由Celera提出。 步骤：取全
13、基因组DNA 纯化酶切或超声波打断 电泳 回收DNA片段 构建质粒文库 转 化宿主菌 扩增培养 提质粒DNA为模板进行 PCR测序 上测序仪处理测序数据补缺 完整基因组序列。. shutgun法全基因组DNA随机酶切成小片段拼接补缺完整基因组序列2. 层次散弹（hierarchical shutgun） 第二种是层次散弹（hierarchical shutgun）。即把 大的基因组先进行分层，如染色体编号、染色体下片 段编号、小片段上作物理标记，然后再对小片段测序 ，这样使最后“拼接”变得容易得多。测序的两种思路四、建立物理图谱和遗传图谱 染色体编号 先将各个染色体分离，编号：1#，1#，2#， 2# 以染色体为单位甚至更小的单位用shut-gun方 法再进行测序。路标技术 在不能切割成小片段进而编号时，一条染色体上要设 计几个标志，相当于编号，称路标技术（Landmark） ，这个路标是有顺序的，路标愈多，之间的距离愈近
