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1、第九章基因工程与基因组学第一节 基因工程 概念:利用DNA重组技术,把一个细胞中的基 因转移到另一个细胞中,并使该基因控制的性 状能够正确表达,这项技术称基因工程(gene engineering).细菌的接合:1.原理: 噬菌体转导U形(戴维斯)管实验: 1950年,Davis,B设计, A: trp- his+ B: trp+ his- 混合培养后,10-7细胞得到100个trp+ his+ 。没有接合,怎么而来?研究结果: 是一种温和型噬菌体(P22)携带的结果。 噬菌体:称可过滤因子。 概念:以噬菌体为媒介,把一个细菌的基因导 入另一细菌,这一过程称转导(transduction).烈
2、性噬菌体:T2, T4 温和型噬菌体: , P1, P22亮氨酸转导这就是天然基因工程(基因转 移)过程!2. 几个概念: 供体(donor):品系甲,提供基因; 受体(recepter):品系乙,接受基因; 目的基因(target gene):被转移的基因,亮氨 酸; 载体(vecter):噬菌体,携带基因;DNA重组(recombination):噬菌体插入大肠 杆菌的过程,目的基因与载体结合;几个概念2 限制性内切核酸酶(restriction endonucleases) 和连接酶:DNA切开与连接; 感染(infection): 载体进入受体的一种方式; 转化、转导等。 基因繁殖且表
3、达。3. 基因工程的主要步骤: . 目的基因获得: 物理分离法; 化学合成法; 酶切(鸟枪射击)法; 逆转录法; 噬菌体摄取法; 基因组克隆法等. 载体与DNA重组 合适载体;质粒、噬菌体、转座子等 限制性内切酶; 连接酶;重组1重组2内切酶 把重组DNA分子送入受体: 转化: 转导; 基因枪 注射; 其它一切介导方法。转化注射电激基因枪脂质体示意图脂质体4. 基因工程的成就: 1.三大支柱:干扰素、人的脑激素、胰岛素 2. 人的抗凝血因子转到羊身上; 3. 抗虫:Bt基因、胰蛋白酶基因、 4. 抗病:抗病毒基因5. 基因工程要做些什么? 1. 固N; 2. 大豆蛋白基因转到水稻中; 3. 动
4、物蛋白基因转到植物中; 4. 疫苗抗原转到植物中; 5. 新的抗病虫基因转到新品种上; 6. 大象的生长基因转到猪身上; 7. 观赏新类型;等等第二节 基因组学 概念:研究生物体全基因组的分子结构和遗传 功能的学科称基因组学(genomics)。 结构基因组学(structural genomics):以分析 测定基因组核苷酸序列为主要目的的基因组研 究; 功能基因组学(functional genomics):研究全 基因组的基因及其功能,又叫后基因组学( post-genomics)。基因组计划(genome project): 研究一个基因组的全部工作的规划: 1.测定全部DNA序列;
5、2.构建基因组的物理图谱; 3.构建基因组的遗传图谱; 4.构建基因组的转录图谱; 5.分析基因组的功能。目前实施的基因组计划:微生物:大肠杆菌、噬菌体、酵母 植物:拟南芥、水稻; 动物:果蝇、猪、牛、鸡等;人。例:人类基因组计划(HGP, human genome project) 1986.3.7 美国一个叫dulbecco在Science 上发表一篇文 章:“肿瘤研究的一个转折点:人类基因组的全序列分 析”。人有310 9 bp,工作是浩瀚的。 1990年,美国国立卫生院对“人类基因组计划”立项, 拨款30亿美元。 2000年,完成人的基因组草图,完成结构基因组学。 2005年,完成功能
6、基因组学。HGP的目标 1. Generate sets of full-length cDNA clones and sequences that represent human genes and model organisms. (分析出代表人类全部基因和模式生物的 全长cDNA克隆和序列)。 2. Support research on methods for studying functions of nonprotein-coding sequences(产生一 种方法用来研究非蛋白编码序列的功能)。 3. Develop technology for comprehensive
7、analysis of gene expression(研究一些技术用来理解和分析基 因的表达)。4. Improve methods for genome-wide mutagenesis( 研究一些技术用来研究整个基因组的突变产生)。 5. Develop technology for large-scale protein analyses. 研究蛋白质大规模分析技术。显微镜下人的染色体人的染色体组HGP与中国 1998年8月11日,中科院遗传所“人类基因 组中心”成立。1999年2月,中心决定进行大规模基因组测 序,以创造加入“国际测序俱乐部”的条件。 同年7月7日,中国在国际人类基因
8、组测序协作 组登记,申请加入“国际测序俱乐部”。 并承担了1%的染色体测序任务。中国的基因组工作室我国的工作人员正在测序HGP实验室(图)中国基因组人员在工作一、建立DNA(cDNA)文库 创造人的46个染色体的DNA文库,该DNA是工 作的材料。测序可能要做若干次重复,因此, 要有一定数量的DNA做原料,即,可克隆的 DNA片段(clonable Fragmant)。 DNA文库有cDNA(complementary DNA)文 库和gDNA(genome DNA)文库两种。1. 取材 选取的原始个体不同,DNA文库的基因序列, DNA序列肯定不同。白种人、黄种人、黑种人 、不同地区的人,选
9、什么人,研究者有他们的 想法,可能是科学家,也可能是他们自己,更 可能是随机取样;2.文库的建立 DNA文库技术 RH(Radiation Hybrid) YAC(yeast Artificial chromosome) BAC(Bacterial Artificial chromosome) PAC,cosmid,fosmid等.RH (Radiation Hybrid)方法 将人的细胞(染色体)用X-光照射打断染色体,该细胞与鼠细胞融合,使DNA片段能插入到鼠的染色体上,扩增的细胞株中的人DNA片段(5-10Mb),得到克隆(也有STS出现),用作分析。YAC(Yeast Artifici
10、al chromosome)方法 利用酵母染色体结构和复制系统(着丝点、端 粒、复制子)来复制人的DNA分子;可克隆 2002000kb的DNA; 特点:克隆片段大,可达Mb级别,用作自动 分析材料。pYACBAC(Bacterial Artificial Chromosome ): 把人的染色体片段嵌入细菌的质粒(F质粒) 中,可运载扩增100300kb DNA。 特点:较小,便于普通测序。但自动测序时显 得小。PAC文库 PAC(P1-derived Artificial chromosome)是P1 噬菌体为载体的DNA文库。可以看出,PAC肯 定较小,携带90-150kb 的DNA。L
11、oannou将 PAC用于人基因组,构建了12万个插入片段, 长度为110-120kb,容量是人基因组的3倍。 1200001101000=1.321010/(3109)=4.4倍 ,保守即约为3倍。TAC 文库TAC(Transformation-competent Artificial chromosome)叫可转化人工染色体。载体是pYLTAC7(p1质粒和Ri质粒),可用于 植物。HAC文库 HAC(Human Artificial chromosome)叫人类人 工染色体。二、DNA序列测定原理 将DNA片段用荧光等分析仪,测出DNA序列碱 基排列顺序。 DNA 序列测定方法: 1.
12、化学降解法:G反应;G+T反应;T+C反应 和C反应; 2.Sanger的双脱氧法:A/T/G/C四个反应。 3.自动测序法1. Sanger 的测序方法 CGCTCAGC TGGTGATT GTGTSanger2.连续测序法 一轮 随机引物 二轮 测出的序列 作为二轮的引物 三轮 测出的序列 作为三轮的引物三、测序-及连接方法的遴选 对文库中的各片段逐一测序,测序后的连接则是一个 巨大的任务(生物信息学)。目前有两种思路: 1. 第一种是全基因组散弹法(whole genome shut-gun) :即从文库中随机取,然后分析,分析后再根据碱基 序列进行拼接,由Celera提出。 步骤:取全
13、基因组DNA 纯化酶切或超声波打断 电泳 回收DNA片段 构建质粒文库 转 化宿主菌 扩增培养 提质粒DNA为模板进行 PCR测序 上测序仪处理测序数据补缺 完整基因组序列。. shutgun法全基因组DNA随机酶切成小片段拼接补缺完整基因组序列2. 层次散弹(hierarchical shutgun) 第二种是层次散弹(hierarchical shutgun)。即把 大的基因组先进行分层,如染色体编号、染色体下片 段编号、小片段上作物理标记,然后再对小片段测序 ,这样使最后“拼接”变得容易得多。测序的两种思路四、建立物理图谱和遗传图谱 染色体编号 先将各个染色体分离,编号:1#,1#,2#, 2# 以染色体为单位甚至更小的单位用shut-gun方 法再进行测序。路标技术 在不能切割成小片段进而编号时,一条染色体上要设 计几个标志,相当于编号,称路标技术(Landmark) ,这个路标是有顺序的,路标愈多,之间的距离愈近