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1、第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱法n是一种以液体为流动相的现代柱色谱分 离分析方法。 原则上只要能溶解在流动 相中的物质都可以用高效液相色谱法分 析，尤其适合那些不宜用气相色谱法分 析的难挥发性物质、热不稳定物质、离 子型物质和生物大分子等。在目前已知 的有机化合物中，有80的有机化合物 能用高效液相色谱法分析。3-1高效液相色谱分析法的特 点n一、高压 一般供应压力1.53.5104Kpa n(为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m）， 液体的流动相 高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的 特点之一。)n二、高速 移动相流速可达110ml/min，在 分析柱内
2、线速度为3cm/s以上，接近于气相色 谱中的载气速度n三、高效 具有高的分离效率和分辨本领，柱 效可达3万10万四、高灵敏度n主要采用了基于光学原理的检测器，如紫外 、荧光检测器，最小检测量分别为10-9g、10- 11gn五、测定样品范围广 只有15%-20% 的低沸 点、低分子量（400）、热稳定性好的化合 物可用气相色谱法分离，其余的有机物原则 上都可用HPLC分离、分析。n但是，设备昂贵，柱填充剂和流动相也比GC 贵3-2影响色谱峰扩散和色谱分 离的因素n气相色谱分离的基本理论同样适用于液 相色谱，但由于HPLC和GC 的流动相 不同，两者有些差异。n速率方程式为:H=He + Hd/
3、+（Hs+Hm+Hsm）一、涡流扩散相He（GC为A）n He=2dP 、dP的含义与GC中相同 ，可见均匀、细小的颗粒填料，装柱严 密均匀在HPLC中同样必需。HPLC的 填料粒径为310m二、分子扩散相（纵向扩散相 ）Hd/（GC为B/）nHd=CdDm Cd为一常数，Dm 扩散系 数（组分在流动相中）n由于分子在液体中的扩散系数比在气体 中要小45个数量级，Dm与黏度有关, 大, 扩散慢，Dm小， 小, 扩散快, Dm大 。 所以，当0.5cm/s，Hd的影响小且 恒定。这是HPLC与GC的很大不同点。三、传质阻力项 Hs+Hm+Hsm （GC中为C）nHs固定相传质阻力；Hm流动 的流
4、动相传质阻力；Hsm滞留的流 动相传质阻力，是增加传质阻力的最大 影响因素。故改进固定相的结构n是提高液相色谱柱效的重要问题。n Hs=Csdf2/Ds Hm=Cmdp2/Dm Hsm=Csmdp2/Dm nDs与Dm一样，均与液体粘度有关， ，Ds、Dm则小，可见，与GC类似， 小的颗粒、填料、薄的液膜厚度，低粘 度的液固相都有利于传质，提高柱效。综上所述nHPLC中影响柱效的主要因素是传质项 ，分子扩散项很小，HPLC的H曲线 及与GC的H曲线比较见下图。HPLC的H曲线 与GC的H曲线HLPC的典型H-u图n是一段斜率不大的直线，无最佳点， 对H的影响也不会很大。n之外，进样（进样器死体
5、积、进样点） 、柱后连接管的体积、检测器的死体积都可导致色谱峰扩展（柱外展宽）。3-3高效液相色谱法的主要类 型及其分离原理n根据分离机制的不同，HPLC可分为四种基本类型：n分配色谱n吸附色谱n离子交换色谱n尺寸排斥色谱。具体包括：n液液色谱法（LLC），包括正相、反相（两 相极性相反）、化学键合相（CBC）；n液固色谱法（LSC）；n离子交换色谱法（IEC）；n离子色谱法（IC）；n离子对色谱法（IPC）；n空间排阻色谱法(SEC), 包括： （1）GFC 凝胶过滤色谱，水为流动相 （2）GPC 凝胶渗透色谱，非水做流动相一、LLC和化学键合相色谱n K=Cs/Cm=kVm/VsnGC中K
6、主要决定于组分和固定相的性质 HPLC中流动相也有很大影响力，k值大 的R值大。LLC的三种类型n1）正相LLC 流动相极性固定相极 性n2）反相LLC 流动相极性固定相极 性n3）化合键合相色谱（担体与固定液之 间化学键合为共价键，产生化合键合固 定相，如 Si-O-CN等优点：防止固定液流失。LLCn分离原理：基于试样组分在两相的溶解 度的差异。组分在固定相和流动相上 的分配。n最适用于同系物的分离。二、LSCn基本原理：组分在固定相吸附剂上 的吸附与解吸；根据物质吸附作用的 不同来进行分离的。n其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分 子（S）在吸附剂活性表面的竞争吸附nXm+nSaXa+nS
7、m a吸附剂 中 nK=XaSmn/XmSan m 流动相 中LSCn组分在吸附剂中的浓度大或溶剂分子在流动 相中的浓度大，都导致K大，tR大n适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 ，对具有不同官能团的化合物和异构体有较 高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等 ，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。三、离子交换色谱法（IEC）n 阳离子交换：M+ +（Na+ -O3S-树脂） =M+ -O3S-树脂+ Na+n 阴离子交换：X- +（Cl- +R4N-树脂） = X- +R4N-树脂+ Cl-n KM= M+ -O3S-Na+ / M+
8、Na+ - O3S-IEC固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子 离子交换树脂；流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。分离原理：n离子间亲和力的大小。组分在固定相上 发生反复离子交换反应，样品组分与离 子交换树脂的亲和力越大，滞留时间越 长，反之亦然。n适用：离子及可离解的化合物，氨基酸 、核酸等。有机离子化合物与非离子化 合物的鉴定，常用紫外或荧光检测器。四、离子色谱法（IC）n离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，它与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术
9、和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。n 所以它是交换色谱法的一个变种，也叫双柱离子色谱法，比离子交换色谱法多一个抑制柱，其作用是扣除（抑制）洗脱液的背景电导。如（1）阴离子的分析：n如测定NaBr水溶液中NaBr的浓度n分离柱： R-OH + NaBrR-Br +NaOHn 阴离子交换树脂n用NaOH做洗脱液：n NaOH + R-BrNaBr +R-OHn流出分离柱的溶液为NaOH ，NaBr （ H2O）抑制柱：nR-H+NaOHR-Na + H2On 阳离子交换树脂n R-H +NaBr = R-Na +HBrnNaOHH2O，消除了本底电导的影响 （H2O电导小）nNaBrHBr
10、 H+的淌度是Na+的7倍，检 测灵敏度高*淌度：n在电场梯度为 1V/cm，T=25C的水溶液中离子运动的速度称为淌度 cm/s）(2)阳离子分析n用无机酸如稀HCl或稀HNO3作为洗脱剂 。分离柱中填充低交换容量的H+型阳离 子交换树脂，抑制柱中填充高交换容量 的强碱性阴离子交换树脂。抑制反应为：n被测阳离子 R一NR3+OH十M+Cl- R NR3+Cl 十M+OHn 洗脱剂离子 R一NR3+OH十H+Cl- RNR3+C1十H2On洗脱剂中HCl转变为H2O，不干扰测定, 被测阳离子则因OH的离子淌度为Cl 的2.6倍，提高了检测灵敏度Q c离子色谱法n常用电导检测器，若选择到背景电导
11、低 的洗脱液，也可不用抑制柱，若组分有 特点，也可用其他检测器n适用：无机阴离子、阳离子的分离鉴定 。五、离子对色谱法（IPC）n离子对色谱法是20世纪70年代中期发展 起来的。其中, 反相离于对色谱法应用 较多，它是在强极性的流动相中加入与 被测离子电荷相反的平衡离子。从而实 现色谱分离的。常用的平衡离子试剂有 烷基磺酸钠和季胺盐两类。前者适用于 分离有机碱类和有机阳离子，后者适用 于分离有机酸类和有机阴离子。原理：nIPC是将一种（或多种）与溶质分子电 荷相反的离子（称对离子或反离子）加 到流动相中，使其与组分离子结合形成 疏水型离子对化合物，使其能够在两 相之间进行分配，从而控制溶质离子
12、 的tR。原理（不十分明确）n （1）离子对模型：离子对形成：A-（ 水相）+ B+（水相）=A- B+（有机相）n （2）离子交换模型。该模型认为平衡 离子被吸附或进入固定相、形成固定相 离子交换剂，试样离子则在其表面发生 离子交换。（3）离子相互作用模型。n该模型认为被分析离子与固定相既存在吸附 作用，也存在静电作用。n由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被 非极性相（有机相）提取，组分离子的性质 不同，它与反离子形成离子对的能力大小不 同，所以形成的离子对的疏水性质不同，导 致各组分离子在固定相中滞留时间的不同， 因而出峰先后不同，这是离子对色谱法分离 的基本原理。反相离子对色谱：n
13、非极性的疏水固定相(C-18柱)或十八烷键合相（ODS）等，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X -后，在两相间分配。此法操作简单只要改变流动相的pH值、反离子的浓度 和种类就可改变kn如果被分析的的离子是弱碱的共轭酸或 者是弱酸的共轭碱则可用H+或OH作 为平衡离子，即在流动相中加入缓冲剂 调节pH，使被分析离子转化成它的共轭 酸或共轭碱，在两相间分配。这种方法 又称为“离子抑制色谱法”。反相离子对色谱法n适于易电离的有机化合物的分离。n它使用普通的反相柱。n还可以进行梯度洗提，故而得到普遍应 用。对离子的选择阴离子分离：常采用烷基铵
14、类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。六、空间排阻色谱法（SEC）n又称凝胶渗透法，凝胶过滤法。n固定相：凝胶（gel）。凝胶是一种经过交联 并具有立体网状结构的多聚体（类似于分子 筛）。n原 理：按分子大小分离。当试样随流动相 进入色谱柱在凝胶间隙及孔穴旁流过时，大 分子被排阻在孔穴之外，中等分子进入孔穴 中部，小分子可以渗透到孔穴低部，因而分 别先后被洗脱，实现分离。摩尔质量n大的组分先流出，摩尔质量小的组分后 流出。由于溶剂分子通常较组分小，它 们最后被洗脱，n在tM时，以空气峰作标志，结果使tM tR，n这和前述几种
15、色谱法所看到的情况是相 反的。空间排阻色谱原理示意图凝胶的排斥极限n排斥在所有胶孔之外的大分子不能分离 ，以单一峰出现（C,V0）n凝胶的全渗透极限AVcB n完全渗入凝胶孔穴中的小分子也不能分 离，一起以一个单一峰出现（F,Vt）空间排阻色谱示意图排阻色谱法特点n概括起来，凝胶色谱具有如下特点。ntMtRn固定相和流动相选择容易。 n保留时间是分子尺寸的函数，因此有可能提 供分子结构的某些信息。n保留时间短，谱峰窄，容易检测，可用灵敏 度较低的检测器。n固定相与分子间的作用力极弱，趋于零，即 柱子不能很强地保留分子，因此柱寿命长。4）适用n M2000n 不能分辨分子大小相近的化合物，M的 差别在10%以上分子n 主要用来获得分散性聚合物的相对分子 质量分布情况。3-4高效液相色谱分离类型 的选择n综上所述，各种液相色谱有其不同的特 点。在实际工作中，应根据样品性质（ 如是否溶于水，溶于酸或碱，是否离散 、高分子、异构体等）恰当地选择合适 的液相色谱分离法。液相色谱分离类型选择参考表3-5 液相色谱法固定相n一、液液色谱法和离子对色谱法的固 定相（LLC、IPC）n全多孔型担体：由直径100m3 10m，硅胶微粒。表层多孔型担体（ 薄层型微珠担体）。目前5-10m的全 多微粒担体使用最广。固定液：n常用强极性的、氧二丙腈；n
