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1、生物化学实验实验 Folin-Wu法定量测定血糖的含量一、目的要求 1、掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法 。 2、学会制备无蛋白血滤液。二、实验原理 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性钼钼酸试剂试剂 蓝蓝色钼钼化合物 OD420比色 无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热 反应，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸 性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝 。 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而 Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定 量的测定。二、实验仪器1、新鲜兔子血 2、滤纸
2、3、血糖管（25ml） 4、奥氏吸管（1ml） 5、锥形瓶（50ml） 6、 漏斗 7、电炉 8、水浴锅 9、7200型可见分光光度计血糖管奥氏吸管7200型分光光度计1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀
3、释定容 至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=15：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4） 。 四、实验试剂 5、酸性钼酸盐溶液： 称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂 瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。 置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。 1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏
4、吸管吸取全血（已加抗凝剂草酸钠）1ml,缓缓放入50ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO412滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。五、实验步骤2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液；用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml，放入第三支血糖管
5、中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=OD1/OD2 C 10 100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数C=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）OD1=样品液光密度值OD2=标准液光密度值六、结果计算：实验 肝糖元的提取和鉴定一、实验原理糖原在浓碱中稳定，将肝组织先置于浓碱中加热，是蛋白质及其他成分分解而保留肝糖元。再用浓硫酸使糖原脱水生成糖醛衍生物，衍生
6、物和蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的标准葡萄糖一起比色定量。 二、实验仪器 1、 新鲜肝脏 2、 100ml容量瓶 3、 7220分光光度计 4、 水浴锅 5、 试管(ml、2ml、5ml)三、实验试剂 1、0.9%NaCl溶液：0.9gNaCl溶于100ml蒸馏水中 2、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸馏水中 3 、标准葡萄糖溶液（0.05mg/ml）：准确称取5mg分析纯葡萄糖（预先在110干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容至100ml. 4、显色剂：称取0.2g蒽酮加入100ml浓硫酸中。此试剂不稳定，以 临用时配用为宜，冰箱保存可用45天四、实验步骤1、迅速处
7、死小白鼠，立即取出肝脏，用0.9%NaCl溶液洗去附着 的血液并用滤纸吸干，准确称取肝组织0.5g，放入盛有 1.5ml30%NaOH的试管中，置于沸水浴中加热20分钟，取出后冷 却，将管中内溶物全部转移到100ml容量瓶中（用蒸馏水多次洗 涤试管，一并收入容量瓶）加蒸馏水定容。2、取干燥试管三支，注明空白管、标准管、测定管，按下表进行 操作。加毕，摇匀，置沸水浴中10分钟，冷却，以空白管调节零 点，在620nm波长下比色测定。 五、结果计算100g肝组织中所含糖原的克数 =（od测/od标）c标2100（1/1000） （ 100/111） （100/0.5）注：100/111是此法测的葡萄
8、糖含量换算为糖原含量的常数，即100g糖原 用蒽酮试剂显色相当于111g葡萄糖用蒽酮试剂所显得色实验 蛋白质的部分性质一、试验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。第一部分、蛋白质的颜色反应二、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤
9、，滤液 放在冰箱里冷藏备用。 2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷 却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存 。 4、尿素晶体5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、 冰醋酸10、浓硫酸四、实验步骤 （一） 米伦（Millons）反应原理原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。 他能与苯酚
10、及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的 氨基酸中只有酪氨酸含苯酚集团，因此该反应为蛋白质中酪氨 酸存在的依据。 操作操作： 1、苯酚实验： 取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电 炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。 2、蛋白质实验： 取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉 淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。（二） 双缩脲反应原理原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。 双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应 称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也 能进行此反应。双缩脲反应可
11、作为蛋白质定量测定的依据。操作操作： 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体， 此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白 色固体时， 停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀 ，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。（三） 黄色反应原理原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物。操作操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5
12、滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？（四） 茚三酮反应原理原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。操作操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。第二部分、蛋白质的沉淀反应一、试验原理蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。二、实验仪器1、移液管
13、2、吸管 3、试管 4、电炉三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤 液放在冰箱里冷藏备用。 2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 4、95%乙醇。 5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 6、硫酸铜溶液：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、氯化钠晶体 8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 10、1%醋酸溶液。四、实验步骤（一）蛋白质的盐析作用原理原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫
14、酸铵、硫酸钠或氯化钠 等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有 的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定 因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性 。操作操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，在加入饱和硫酸铵溶液2- 4ml，摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸 铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止， 此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质原理原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，
15、致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。操作操作：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。操作操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质原理原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成
16、为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。操作操作：取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度一、实验原理蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的深浅成正比，可用比色法测定。二、实验仪器 1、 试管 2、 吸管 3、 容量瓶 4、 7220分光光度计三、实验试剂1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml
