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1、（一（一 ）化学因素对微生物生长的影响）化学因素对微生物生长的影响（二）细菌的生理生化反应（二）细菌的生理生化反应实验六实验六实验目的：实验目的： 了解常用化学消毒剂对微生物的作用了解常用化学消毒剂对微生物的作用实验一实验一 化学因素对微生物生长的影响化学因素对微生物生长的影响常用的化学消毒剂主要有常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类、有机重金属及其盐类、有机 溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物 、染色剂和表面活性剂等、染色剂和表面活性剂等。实验原理：实验原理：1 1 氧化氧化剂：通过强烈的氧化作用杀死微生物。剂：通过强烈的氧化作用杀死微生物。碘的
2、杀菌力强，碘的杀菌力强，3 37 7碘溶于碘溶于70708383的乙醇的乙醇 中中 成成碘酒碘酒。2 2 重金属盐类：使蛋白质变性、沉淀，使酶失活重金属盐类：使蛋白质变性、沉淀，使酶失活 。 0020020202HgClHgCl2 2（升汞升汞）溶液对大多）溶液对大多 数细菌有致死作用。数细菌有致死作用。 3 3 有机溶剂：使蛋白质及核酸变性、破坏细胞膜有机溶剂：使蛋白质及核酸变性、破坏细胞膜 透性，抑制脱氢酶，氧化酶活性。透性，抑制脱氢酶，氧化酶活性。 乙醇乙醇（70%70%）4 4 表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质，表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质， 可抑菌或杀菌。可抑菌或杀菌
3、。 甲酚甲酚杀菌力最强杀菌力最强 煤酚皂液（煤酚皂液（来苏尔）来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液。为甲酚和肥皂的混合液。新洁尔灭新洁尔灭：破坏细胞的渗透性：破坏细胞的渗透性实验材料实验材料1 1 菌种：菌种：大肠杆菌大肠杆菌2 2 培养基：培养基：牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基3 3 消毒剂：消毒剂：2.5%2.5%碘酒碘酒，0.5%0.5%石碳酸石碳酸，75%75%乙醇乙醇， 100%100%乙醇，乙醇， 1%1%来苏尔来苏尔， 0.25%0.25%新洁尔灭，无菌生理盐水新洁尔灭，无菌生理盐水实验步骤实验步骤 1 1 倒牛肉膏蛋白胨平板倒牛肉膏蛋白胨平板2 2 取取0.2ml0.2ml大肠杆
4、菌菌液加入平板中，涂布均匀。大肠杆菌菌液加入平板中，涂布均匀。3 3 将平板将平板( (皿底）划分为皿底）划分为6 6等份，分别将浸有各种等份，分别将浸有各种 消毒剂的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。消毒剂的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。4 4 将贴好滤纸片的含菌平板，置将贴好滤纸片的含菌平板，置3737倒置培养倒置培养24-24- 48h48h。5 5 测量并记录抑菌圈的直径，根据其直径的大小测量并记录抑菌圈的直径，根据其直径的大小 ，可初步确定测试药品的抑菌效能。，可初步确定测试药品的抑菌效能。（自带尺（自带尺 子）子）实验结果实验结果思考题 书书p97p97思考题第思考题第1111题题
5、消毒剂剂抑（杀杀）菌圈直 径/mm消毒剂剂抑（杀杀）菌圈直 径/mm2.5%2.5%碘酒碘酒5%5%石炭酸（苯酚石炭酸（苯酚) )100100乙醇乙醇1%1%来来苏苏苏苏尔尔 75%75%乙醇乙醇0.25%0.25%新新洁洁洁洁尔尔灭灭灭灭实验二实验二：细菌的生理生化反应细菌的生理生化反应（IMViCIMViC 与硫化氢试验）与硫化氢试验）吲哚（吲哚（I I）、）、甲基红（甲基红（M M）、）、V.P.V.P.试验（试验（ViVi）、柠檬）、柠檬 酸盐利用（酸盐利用（C C）试验。用以将大肠杆菌与其形状十分试验。用以将大肠杆菌与其形状十分 相近的肠杆菌属的细菌鉴别开来。相近的肠杆菌属的细菌鉴别
6、开来。实验目的：实验目的：1 1 学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法认识微生物代谢类型的多样性。认识微生物代谢类型的多样性。2 2 了解了解IMViCIMViC反应在肠道菌鉴定中的意义和方法反应在肠道菌鉴定中的意义和方法实验原理：实验原理：1 1 吲哚试验吲哚试验 ： 用来检测吲哚的产生，有些细菌能产用来检测吲哚的产生，有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙氨酸。氨酸。吲哚吲哚 + + 对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛 红色的玫瑰吲哚红色的玫瑰吲哚色氨酸吲哚玫瑰吲哚吲哚试剂2 2
7、 甲基红试验（甲基红试验（M.RM.R） ：大肠杆菌大肠杆菌与与产气肠杆菌产气肠杆菌在在 利用葡萄糖进行发酵时利用葡萄糖进行发酵时 ，前者可产生大量的混，前者可产生大量的混 合酸，使合酸，使pH4.5pH4.5；后者后者 则产生大量的中性化合则产生大量的中性化合 物丁二醇，物丁二醇，pH4.5pH4.5，因因 此在发酵液中加入甲基此在发酵液中加入甲基 红试剂时，前者呈红色红试剂时，前者呈红色 ，后者呈黄色。，后者呈黄色。葡萄糖葡萄糖乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛 乙酰乙酰CoACoA 甲酸甲酸乙醇乙醇 乙酰乳酸乙酰乳酸二乙酰二乙酰 3-3-羟基丁酮羟基丁酮2,3-2,3-丁二醇丁二醇CO2 H
8、2-乙酰乳酸合成酶-乙酰乳酸脱羧酶2,3-丁二醇脱氢酶一些细菌具有一些细菌具有 - -乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶 系而进行丁二醇发酵。系而进行丁二醇发酵。EMP产气杆菌产气杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌3 V.P.3 V.P.试验试验碱性条件氧红色化合物（与培养基中精氨酸 的胍基结合）发酵途径：葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 二乙酰红色化合物 +胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 大肠杆菌 产气杆菌4 4 柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验：有些细菌如有些细菌如产气肠杆产气肠杆 菌菌能利用柠檬酸盐作能利用柠檬酸盐作 为碳源，产生碱性化为碳源，产生碱性化 合物，使培养基的合物，使培养基的 pH pH 升高
9、，当加入溴升高，当加入溴 麝香草酚蓝指示剂时麝香草酚蓝指示剂时 ，培养基会由绿色变，培养基会由绿色变 为深蓝色。为深蓝色。I M Vi C试验VP test Citrate utilization testIndol testMethyl testI M Vi C 大肠肠杆菌 + + 产产气肠肠杆 菌 + +常用于肠道杆菌的鉴定5 5 硫化氢试验硫化氢试验：有些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，当其遇有些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，当其遇 到培养基中的铅或铁盐时，形成黑色的沉淀物。到培养基中的铅或铁盐时，形成黑色的沉淀物。实验材料实验材料菌种：菌种：大肠杆菌大肠杆菌 、产气杆菌、变形
10、杆菌、产气杆菌、变形杆菌培养基：培养基：蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基（吲哚试验） 葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏普试验）柠檬酸盐斜面培养基、柠檬酸盐斜面培养基、醋酸铅培养基醋酸铅培养基（硫化氢试验）实验步骤实验步骤一一 接种与培养接种与培养1 1 用接种针将大肠杆菌用接种针将大肠杆菌 、变形杆菌分别穿刺接入、变形杆菌分别穿刺接入2 2支支 醋酸铅培养基醋酸铅培养基2 2 将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于2 2支蛋白胨水培支蛋白胨水培 养基（吲哚试验）、养基（吲哚试验）、 4 4支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲 基红试验和
11、基红试验和V.P.V.P.试验）中，置试验）中，置3737培养培养24 -48h 24 -48h 。3 3 柠檬酸盐斜面培养基柠檬酸盐斜面培养基4 4 对照（所有同学共用）对照（所有同学共用）二二 结果观察结果观察( (时间时间) )2 2、学生按实验书所介绍的操作方法进行生化反应试验，将实验、学生按实验书所介绍的操作方法进行生化反应试验，将实验 结果填入下表中（六人一组结果共享）结果填入下表中（六人一组结果共享）菌种菌种吲哚试吲哚试 验验甲基红试甲基红试 验验V.P.V.P.试验试验H H2 2S S试验试验柠檬柠檬 酸盐酸盐大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌 变形杆菌变形杆菌 ）3 3 思考
12、题：见书思考题：见书p120p120思考题第思考题第1 1题题硫化氢试验 培养24h后观察黑色硫化铁的产生。 吲哚试验 在培养24h后的蛋白胨水培养基中加入3-4滴乙 醚，摇动数次，静置1-3min，待乙醚上升后，沿试管徐徐加入 2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应 。 甲基红试验 在培养24h后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加入 甲基红试剂2滴，培养基变红者为阳性，变黄者为阴性。（注意 ：甲基红试剂加得过多，可出现假阳性现象。） 伏普试验 在培养24h后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加 入510滴40KOH，然后加入等量的5-萘酚溶液，用力振 荡，再放入37温箱中保温1530分钟。反应物呈红色者，为 伏普反应阳性。 培养48h后观察柠檬酸盐斜面培养基上是否有细菌生长和是否 变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。实验要求每个人做1个平板的化学因素对微生物生 长的影响每个人做IMViCIMViC 与硫化氢试验与硫化氢试验中的一个 小实验 每组(5-6人)
