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1、金属铜离子与蛋白质内容：内容：l l研究的目的及意义研究的目的及意义l l铜与血清白蛋白铜与血清白蛋白l l铜与血红蛋白铜与血红蛋白l l铜蛋白和铜酶铜蛋白和铜酶研究目的及意义研究目的及意义l在真核生物体内，铜元素参与体内的许多生化反应， 如作为电子传递链中的供体或受体；参与细胞内的呼 吸；维持铁的代谢平衡；用于色素、神经递质的合成 ；作为氧化还原酶参与体内的抗氧化过程。l但体内铜离子浓度过高时会产生毒性，改变细胞内的 氧化还原状态；与某些氨基酸残基的侧链发生非特异 反应，导致蛋白质的错误折叠；与其它物质竞争酶的 活性中心，干扰酶的正常功能；产生活性氧损害机体 的DNA、蛋白质和脂类物质 。l
2、所以，研究铜离子与生物分子的作用有重要意义。铜与血清白蛋白铜与血清白蛋白l血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,它可以与许 多内源性或外源性化合物结合,在生命体内起着重 要的储存和输运作用。l血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅 由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。常 以BSA( bovine serum albumin, 牛血清白蛋白) 和 HSA( human serum albumin, 人血清白蛋白)为研 究对象。l人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗 传方面的研究，而牛血清白蛋白常常作为蛋白 模型进行体外研究，如用于细胞培养，抗体载 体等。lBSA分子由583个氨基酸残基组
3、成。而HSA比 BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。 两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116 位和585位的残基。荧光光谱法l由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 残基,从而能发出荧光。在这些基团中Trp起主要 作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般认为 蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献。l当金属离子与血清白蛋白结合后,可引起蛋白质或 少数金属离子(稀土离子)荧光的改变,由此可进行 定性、定量研究蛋白质构象的变化。l常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合数 和结合常数,用共振能量转移法测定金属离子与蛋 白质分子中色氨酸残基之间的距离。l荧光淬灭可以分为静态淬灭
4、和动态淬灭。能降 低荧光体发光强度的分子称为猝灭剂。基态荧 光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物 ,且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态 猝灭。而激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧 光猝灭则称为动态猝灭。图:Cu2+对BSA溶液荧光发射光谱的影响l研究发现Cu2+能够明显猝灭BSA自身的特征荧 光光谱,并且这种猝灭作用随着Cu2+的浓度的 增大而增强。由于BSA自身的特征荧光主要是 其色氨酸残基(Trp)产生的,表明随着Cu2+浓度 的增加,BSA的骨架结构发生了较大变化,使Trp 暴露出来,造成BSA的荧光猝灭,猝灭机理主要 为静态猝灭。lN-端三肽链 (HSA为Asp1-Ala2-Hi
5、s3 ,BSA为A sp1- Thr2-His3)公认是Cu2+()的强结合位点。通常金 属离子与Asp1的-NH:和His3的咪唑基N及2个去 质子肽氮(加上轴向的Asp1的羧基)配位,形成平面 四边形(四方锥)构型。lN-端三肽链能够结合金属离子的原因应该是在于 His咪唑基N的配位能力,还有三肽链的灵活易变, 可以折叠围绕金属离子形成所需的特定空间构型 。铜离子与血红蛋白铜离子与血红蛋白1. 1. 血红蛋白简介血红蛋白简介l血红蛋白（Hemoglobin,简称Hb）在体内担任的 功能是输送氧气，它能把从肺携带的氧经由动脉 血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧 化碳经静脉血送到肺再排
6、出体外。l血红蛋白化学式为 C3032H4816O812N780S8Fe4 其分 子量约为64500，是含有4个肽链的四聚体。它是 由四个亚基构成，分别为两个亚基和两个亚基 ，血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素 分子构成。l肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红 素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构 又被称为珠蛋白。l血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在 卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原 子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第 8位上一个组氨酸残基中的氮原子从卟啉分子 平面的上方与亚铁离子配位结合。血红素与血红蛋白结构l当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子 从卟啉
7、环下方与亚铁离子配位结合，而当血红 蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。 血红素与它周围的疏水性氨基酸残基依靠范德 华力保持确定的空间构象。铜离子与血红蛋白相互作用l血红蛋白在280nm附近有一个吸收峰，这是由于蛋白 质中芳香族氨基酸共轭键的紫外吸收所致，在400nm 附近有一个索瑞(soret)吸收峰，这是血红素卟啉环的 *跃迁带，为强吸收峰。l测试牛血红蛋白醋酸缓冲液在加入铜离子醋酸缓冲液 前后的紫外光谱发现，在血红蛋白溶液中加入铜离子 后，不论加入的铜离子浓度有多大，在280nm处的吸 收峰均消失，而其400nm附近的强吸收峰则随着铜离 子浓度的增大降低越来越明显(下图左)，表明铜离
8、子 浓度越大，对蛋白质*跃迁带的破坏性越大。l左：2mol/L血红蛋白与不同浓度铜离子反应分钟后的紫 外光谱图l右：血红蛋白与铜离子相互作用时随时间变化的紫外光谱 图l由此推测，Cu2+的加入，破坏了血红蛋白中芳香族的共轭 结构；而血红素400nm处的soret吸收峰随着时间的变化 逐渐减弱,于是，在不含铜离子的2mol/L血红蛋白溶液中 滴加不同浓度的Fe2+ ，发现随着Fe2+的加入，400nm处的 吸收峰增强。l表明400nm处的吸收峰是血红素Fe2+形成的卟啉环的特征 吸收峰。血红蛋白在370nm处无明显的吸收峰，当铜离子 加入后，此处吸收峰明显增强。当反应进行了9小时后， 形成了一个
9、很宽的吸收带，推测是Cu2+取代Fe2+后与血红 素卟啉环所形成铜络合物的吸收峰。 左：铜离子、铁离子与血红蛋白反应的紫外光谱图右：铜离子与血红蛋白反应16小时的紫外光谱图l最后采用电化学微分脉冲伏安法研究了Cu2+与 Fe2+间的作用过程，进一步证实了紫外光谱得到 的结论。l亚铁血红素离子以铁为中心体，形成6配位的正八 面体弱场。按晶体场理论，Cu2+外层电子的3d9结 构比Fe2+的3d6结构更容易形成稳定的配合物，导 致Cu2+在与血红素中的Fe2+进行竞争配位反应时 获得优势，使得铜离子取代了血红素中的亚铁离 子，从而使得体系的电化学性质及紫外光谱图都 发生了一定程度的变化。铜蛋白和铜
10、酶铜蛋白和铜酶l金属酶的成键方式、配位环境和空间结构与配位化合 物极为类似。配位化学的理论观点和方法可以用来模 拟金属酶生物活性配合物的结构以及结构-性质-功能 的关系, 推定作用机理。l通过配体的设计和剪裁合成出与天然酶活性中心结构 相似的模型配合物, 模拟酶的结构和功能, 这对没有获 得单晶结构、功能及反应机理尚不完全清楚的金属酶 特别适用, 可以得到一些从天然酶研究中不可能得到 的信息。对铜蛋白以及含铜金属模拟酶的研究是近年 来仿生化学工作者研究的热点之一。l铜蛋白质参与生物体内的电子传递、氧化还原 、氧的输送以及活化过程。铜蛋白质按其光谱 性质可分为三类: l型铜, 600nm 附近有
11、非常强的吸收, 具有小 的超精细偶合常数; l型铜, 具有一般铜() 配合物相近的分子吸 光系数和超精细偶合常数; l型铜, 两个铜原子彼此呈反强磁性相互作用, 在 330nm 附近存在强吸收。l按活性结构中含铜原子的个数又可分为单核、 双核和多核铜蛋白。含铜电子传递蛋白含铜电子传递蛋白- -型铜蛋白型铜蛋白l目前已知的型铜蛋白都是参与电子传递反应 的铜蛋白，该类蛋白一般呈深蓝色，所以也称 蓝铜蛋白。l根据晶体结构，I型铜蛋白中铜的配位环境为 N2SS*，即两个His侧链上的咪唑氮原子、一 个Cys侧链上的硫原子和一个Met侧链上的硫 原子参与铜的配位，形成一个扭曲的四面体结 构。蓝铜蛋白（蓝
12、铜蛋白（I I型铜蛋白）的谱学特征主要型铜蛋白）的谱学特征主要 有：有：l紫外光谱在590625 nm范围内有很强的 LMCT吸收（配体到金属的电荷跃迁）；l电子自旋光谱中，由铜的核自旋引起的超精细 偶合常数非常小，这是由于Cu-S键的共价性 较大、键长较短造成的；l与一般铜配合物的氧化还原电位（约160 mV ）相比，I型铜蛋白的氧化还原电位都比较高 （200700 mV）。型铜蛋白型铜蛋白质体蓝素质体蓝素l质体蓝素存在于植物和藻类的叶绿体中，在光 合作用下，从细胞色素接受电子再传递给叶绿 体。质体蓝素的分子质量约为11000 D，氧化 还原电位为370 mV左右。l它的活性中心的铜处于变形
13、的四面体构型，由 两个His侧链上的咪唑氮原子、一个Cys侧链上 的硫原子和一个Met侧链上的硫原子与铜配位 。 氧化型质体蓝素的结构基本上不随pH变化而变化，而 还原型质体蓝素的结构随pH变化而变化，当pH较低时， His87发生质子化，而且其咪唑环发生旋转不再与铜离子 配位。型铜蛋白型铜蛋白阿祖林阿祖林( (天青蛋白天青蛋白) )l它是从荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌等细菌中分 离得到的，相对分子质量为1460017000，含有 一个铜离子，氧化还原电位为280340 mV。在 电子传递体系中，阿祖林将电子传递给细胞色素 ，但供电子体尚不清楚。l在阿祖林的活性中心中，两个His的咪唑氮原子和
14、一个Cys的硫原子形成一个三角形，Met上的硫原 子和一个蛋白链中的酰胺氧原子分别从三角形的 两边与中心铜离子有弱配位作用。型铜蛋白型铜蛋白- -铜锌超氧化物歧化酶铜锌超氧化物歧化酶l与型铜蛋白相比，型铜蛋白活性中心在谱 学上有几点变化： (1) 铜的氧化还原电位向正的方向移动； (2) 与铜配位的原子由硫变为氮或氧，铜采取典 型的四方锥配位构型； (3) 电子光谱中吸收强度减弱； (4) 电子自旋光谱中超精细偶合常数变大。l型铜蛋白中的铜一般处于配位不饱和状态，即留有 空位，从而可以结合底物分子，并进行催化反应。l代表蛋白：铜锌超氧化物歧化酶（铜锌SOD），它能 有效地催化分解超氧负离子，是
15、一种很好的抗氧化剂 ，起到保护生物体的作用。lCu2Zn2SOD中含有两个相同的亚基，其中每个亚 基中含有一个Cu2+和一个Zn2+，他们通过一个组氨酸 侧链上的咪唑基团桥联。两个亚基之间主要是通过非 共价键的疏水作用缔合在一起。铜锌SODl铜锌SOD中每个铜离子与四个组氨酸侧链上的咪 唑氮原子配位，形成一个变形的四边形，还有一 个水分子在轴向上与铜离子配位，使铜离子为五 配位的变形四方锥构型。每个锌离子为四配位的 变形四面体构型，由三个组氨酸侧链的咪唑氮原 子和一个天冬氨酸的羧基氧原子与锌离子配位而 成。l在这个酶中,Cu2+可能决定了酶的催化特异性，而 Zn2+ 则可能起到稳定蛋白质结构的
16、作用。但全酶 的活性需要两只协同作用。含铜氧载体含铜氧载体- -型铜蛋白型铜蛋白l型铜蛋白的主要特点是在其活性中心含有两 个铜离子，并且两个铜离子之间存在强的相互 作用。l典型代表有血蓝蛋白和酪氨酸酶。l血蓝蛋白是一种氧载体，存在于蜗虫、章鱼等 甲壳类和软体类动物的血液中。还原型血蓝蛋白l还原型血蓝蛋白的活性中心含有两个一价铜离子 ，每个铜离子与三个组氨酸侧链的咪唑氮原子配 位，两个铜离子之间未发现桥联配体。两个铜离 子之间的空腔正好容纳一个氧分子。l氧化型血蓝蛋白中尽管铜离子为二价d9构型，但 由于两个二价铜离子之间存在很强的反铁磁相互 作用，以致在室温条件下，该双核铜活性中心呈 抗磁性。氧分子结合到血蓝蛋白后，以过氧负离 子状态存在酪氨酸酶l酪氨酸酶存在于哺乳动物中，具有两种不同的 催化活性，它既可以催化氧化邻苯二酚（儿茶 酚），又可以催化对甲苯酚的羟基化反应，即 酪氨酸酶具有儿茶酚酶和甲苯酚酶的活性。L- 酪氨酸在酪氨酸酶的作用下被氧化为L-多巴， 进一步被氧化生成皮肤黑色素。酪
