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1、血红蛋白与核黄素的凝胶层 析分离电液20104283班 制作人：成洁琴 组员：严文彦 刘秀 柯坤血红蛋白与核黄素血红蛋白1 .结构 ：血红蛋白（Hb）是由两对珠蛋白肽 链和 4 个亚铁血红素构成。珠蛋白 4条肽链（ 、链）；亚铁血红素：原卟啉、铁。 2 .特点 ：（1）正常情况下，99%Hb为还原 Hb（HbA），1%为高铁Hb（HbF）。（2） 只有Fe2+状态的Hb才能与氧结合，称为氧和 血红蛋白。（3）在人体生长不同时期，Hb的 种类与比例不同。出生后3个月，HbA95%， 而HbF降至1%以下。（4）血红蛋白合成受激 素（红细胞生成素、雄激素）调节。（5）相 对分子质量为64458。（
2、6）降解产物为珠蛋 白、血红素。核黄素维生素B2，又称核黄素，维他命B2。它是人体 必需的13种维生素之一，作为维生素B族的成 员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶 于稀的氢氧化钠溶液。维生素B2是机体中许多 酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能 量代谢。 分子式： C17H20N4O6 分子量： 376.37 熔点： 290 水溶性： 0.07 g/L (20) 比旋光度： -135 实验目的（1）掌握凝胶层析的原理。 （2）掌握柱层析的基本装置。 （3）熟悉凝胶层析的操作过程。层析技术层析技术的概念：任何层析都有两层:固定相与流动相，两相互不溶。u 固定相由层析介质组成，可以是固体
3、或液体。这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解于交换作用， 对层析的分离效果起关键作用。u 流动相只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移 动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱剂。它也是层析中的 重要影响因素之一。 层析法的特点： 分辨力高 分析效率高 灵敏度 应用广泛局限性： 在定量分析中需要纯制的标准物质 不能精确地解决物质的化学结构问题凝胶层析常用的层析方法：吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析凝胶层析：是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤 ，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载 体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和
4、，可在相当广的温度范围 下进行，不需要有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 本实验要求用Sephadex G-25（ G-25型交联葡聚糖凝 胶） 凝胶层析柱将血红蛋白与核黄素的混合液分离 ，并测出洗脱曲线。实验原理凝胶层析原理 凝胶层析柱中装着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒内部不是实心的 ，而是呈三维多孔网状结构。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时 ，大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能 沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而速度快先流出层析柱。小分子物 质由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，受到来自凝 胶珠内部的阻力，所以流程长
5、而移动速度慢。因此，大的蛋白质直接通过凝 胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要 取决于要纯化的蛋白质分子量。 实验器材与试剂（一）器材1.2cm x 40cm层析柱、1ml微量可调式 移液器、 721E型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分收集器（二）试剂（1）葡聚糖凝胶Sephadex G-25. (2)血红蛋白与核黄素的混合液。（3）洗脱液：0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.3） 或生理盐水实验操作（1）凝胶处理l 将sephadex g-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸 水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾 去上层细粒悬液，如此反复
6、多次。 （2）层析柱的预备用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使 用毛刷，以免擦伤层析柱子内壁，影响层析分离效果。固 定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封 性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出 口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气 泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至35cm高既可关闭 出水口。 柱层析示意图3）装柱将处理好的凝胶在烧杯内用1倍提及的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱 顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开 低端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶体积沉积至25cm 高度为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。（
7、4）平衡 装好后，使层析床稳定510min,然后接上高位贮液 瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流 速为1ml/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡， 使层析床稳定.操作过程中应特别注意：在平衡与洗脱时要将高 位贮液瓶至层析柱的连接管内的气泡全部排出，以免 影响流速；恒压高位贮液瓶内玻璃管底端出口高度 之差不能大于40cm，以免影响流速；平衡过程中 务必防止层析床液体流干。防止层析床液体流干最简 单的方法是使连接高位贮液瓶与层析柱之间的导管形 成U形，U形管底部低于层析柱的出口；如果需要 温度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水。v（5）加样与洗脱。 打开平衡好的层析柱低端出口 ，
8、使柱内溶液流向与床表面相切时关闭出口。将吸 有0.5ml样品的加样滴灌在床表面上1mm处沿管内 壁轻轻转动加样，加完后，打开底端出口使样品流 至床表面，关闭出口，用少量洗脱液同样小心清洗 管内壁12次，使样品流至床表面，然后加洗脱液 加至距床表面23cm高，接上高位贮液瓶并调好流 速即开始洗脱。注意在加样和洗脱过程中应缓慢加 入液体，防止冲坏床表面，影响分辨率。v（6）收集与测定。 收集时可使用自动部分收集器 或手工操作，每管接洗脱液3ml.直至第二个洗脱峰 降至基线附近。收集后用721E型分光光度计在 451nm波长处以洗脱液为空白，对每管收集液进行 光吸收测定。以收集管数（或洗脱体积）为横
9、坐标 ，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。注 市售凝胶如需彻底处理，可在溶胀后再用 0.5mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCL溶液在室温 中浸泡半小时，但注意必须避免在酸或碱中 加热。另外，用过的凝胶柱如需再生，可用 0.1mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCL洗涤以去掉 堵住网孔的杂质，然后用蒸馏水洗至中性备 有。一般使用几次后就需要再生了。思考题（1）说明凝胶层析的原理 答：单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足 够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小 的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部 的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长！凝胶中只有很少的孔 径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝 胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 （2）层析柱中的“纹路”，气泡和凹凸不平的床表面对层析效果有何影响 ？（3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导管，有防止层析床液体流干 的作用，说明其原理。（4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
