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1、Chapter.16 色谱分析法概述信建豪第一节 色谱法的历史、分类和发展一、色谱的历史 .1903年，俄国植物学家Mikhail Tswett 最先发明。他采用填充有固体CaCO3细颗粒的玻璃柱，将植物色素的提取物加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱。(希腊语中 “chroma”=color; “graphein”=write)。 20世纪30到40年代出现了薄层色谱和纸色谱. 1941年,马丁和辛格提出用气体代替液体的可能性, 出现了分配色谱,还提出了著名的塔板理论,并于1952 年获得了诺贝尔奖. 1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附的
2、研究而 获得了诺贝尔奖. 20世纪60年代,范第姆特(Van Deameter)提出速率 理论;同时代出现了气质联用技术;70年代高效液相色 谱飞速发展;之后,产生了超临界流体色谱、毛细管电 色谱等等。二、色谱法的分类：三、色谱法的发展趋势 新型固定相和检测器的研制 色谱新方法的研究 色谱联用技术的开发 色谱专家系统的开发四、色谱分析法的特点 1.选择性高 2.灵敏度高 3.效能高 4.分析速度快 5.应用范围广总结： 1.色谱：混合色素被分为不同色带的现像。（像 一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱现象 一样） 2.色谱法：将待分析样品的各组分一一进行分离 ，然后顺序检测各组分的方法。 3
3、.色谱法基本组成部分：固定相和流动相。 4.色谱法的用途：分离（实质）分析第二节 色谱过程和基本原理一、色谱过程：return二、色谱分离的基本原理1.组分移动速度低于流动相 证明：各组分和固定相存在一定的化学亲和力 2.各组分移动速度不同 证明：各组分和固定相的亲和力大小不同化学亲和力定向力 诱导力 色散力 氢键 超分子作用三、色谱流出曲线和基本概念(一)色谱流出曲线和色谱峰:1.色谱流出曲线：由检测器输出的电信号强度对时间所绘制的曲线（色谱图）2.基线：在操作条件下，没有组分流出时的色谱流出曲线。3.色谱峰：流出曲线上的突起部分。（对称形正态分布曲线）对称因子：fs=W0.05h/2A=(
4、A+B)/2A其中，fs为0.05倍色谱峰高处的色谱峰宽；A，B分别为在该处的色谱峰 前沿与后沿和色谱峰顶点至基线的垂线之间的距离。fs1.05 拖尾峰fsAl3+Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+ Cd2+Cu2+ Co2+ Mg2+ Zn2+ Mn2+Ag+Cs+Rb+K+ NH4+Na+H+Li+*弱酸性阳离子交换树酯 的基团离解受 溶液中H+的抑制，所以H的交换能力很强 ，甚至大于二价、三价阳离子。常见阴离子在强碱性阴离子交换树脂上的交换顺序为：柠檬酸根PO43-SO42-I-NO3-SCN-NO2- Cl-HCO3-CH3COO-OH-F-2.离子选择剂的交联度和交换容量：交联
5、度交换容 量越大保留时间。3.流动相组成和pH：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力调节pH值的作用主要体现对弱电解质离解的控制，溶质的离解受到抑制则保留时间变短。四、空间排阻色谱法(一)、基本原理：根据被分离组分分了的线团尺寸而进行分离(二)、固定相和流动相：固定相为多孔凝胶。流动相必须能够溶解试样，同时能润湿凝胶。水溶性 用水，非水溶性一般用四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲 酰胺。(三)、保留体积与渗透系数的关系： VRVm(1+KpVs/Vm)该式表明分子线团尺寸大的组分，其渗透系数小，保 留体积也小，因而先被洗脱出柱。第四节 色谱基本理论一、 塔板理论（Plate theory)
6、1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。(一)、塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）试样和新鲜流动相都加在0号塔板上，且塔板之间无纵分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较 少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。色谱
7、柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：n = L / H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：(二)、有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：(三)、有关塔板理论的说明： 1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等； 2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。 3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱 效的
8、参数。 4）塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释： v 峰形为什么会扩张？ v 影响柱效的动力学因素是什么？二. 速率理论（Rate theory）1956年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了van Deemter方程：u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中A分别表示涡流扩散系数；B分子扩散系数；C传质阻力系数（包括
9、液相和固相传质阻力系数）。该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。(一)、涡流扩散项(Multipath term, A)在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组 份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“ 涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均 匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同 峰形展宽。展宽程度以A表示：A=2dp其中dp填充物平均直径；填充不规则因子。可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。(二)、分子扩散项(Longitudinal di
10、ffusion term, B/u)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前 后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为 B=2D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情 况； D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm 表示； 讨论： q 分子量大的组分，Dg小，即B小 q Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小； q 流动相分子量大，Dg 小，即 B 小； q u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u） q 对于液相色谱，因Dm 较小，B 项可忽略。(三)、传质阻力项(M
11、ass-transfer term, Cu)因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。1.气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数Cs和液相传质阻力系数Cl。流动相固液界面固定液组分分子ClCg讨论：F 减小填充颗粒直径dp；F 采用分子量小的流动相，使Dg增加；F 减小液膜厚度df，Cl下降。但此时k又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。F 增加柱温，可增加Dl，但k值也减小，为保持合适Cl值，应控制柱温。
12、2.液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。讨论： v 流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm 、滞留的流动相传质阻力Cs 。分别与填充物大小 dp、扩 散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。 因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增 加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速 度、短柱。 v 固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子 k 和扩散 系数Ds等有关。因此，降低固定相传质阻力的方法有：与 气液色谱中液相传质阻力的表述相同。sm速率理论的要点：1. 被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造 成的分子扩散及传质阻力
13、使气液两相间的分配平衡不能瞬间 达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 2. 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气 流速可提高柱效。 3. 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 4. 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响 减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱 效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影 响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。(四)、流速u由van Deemter方程 H = A + B/u + Cu知道： 当u一定时，仅在A、B、C较小时，H较小，柱效较高；反之则柱
14、效较低，色谱峰将展宽。 以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u涡流扩散项A与流速u无关；低流速区(u小)，B/u大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效； 高流速区(u大)，Cu大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如H2和He为载气，可增加扩散系数，提高柱效； 曲线的最低点对应最佳线速uopt( )下的最小板高Hmin( )； LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在LC中，较低流速可获得较大的柱效。(五)、固定相颗粒大小对板高的影响实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据！但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。板高, H(cm)
