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1、LOGO精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化目录研究背景1实验材料2实验方法3结果及分析4蛋白质的分离纯化v蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必 需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方 法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基 础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而 易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十 分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有 些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑 将增加获取足量蛋白质的难度。目标蛋白质的分离纯化程序主要包括: 材料的选择； 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 蛋白质初步提纯； 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全 纯化； 目标
2、蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保 持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离 纯化过程中要在较低温度下(04)操作，注意使 用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用 剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。 一、蛋白质是两性电解质根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋 白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的 基团。作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点 (pI) ，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都 能在细胞内起一定的缓冲作用。1. 蛋白质的电泳分离凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用 于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该
3、凝 胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制 而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行 选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性 电泳和变性电泳。1 透析2 层析原理3 凝胶过滤4 离子交换层析5 亲和层析6 电泳主要内容1 透 析按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白 混合样品透析袋开始透析处于平衡状态层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换离子交换层析层析、分子筛层析分子筛层析和吸附层
4、析吸附层析等各种层析。2 层析原理 将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。1.2 凝胶过滤层析带网孔的 葡聚糖珠小分子进入 葡聚糖珠内大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶 珠蛋白质Mr=49,000
5、洗出 液中 的蛋 白质 浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白MrMr“ “ 选择性曲线选择性曲线 ” ” G-200G-100logMrKav如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有SO3 或COO基团，通常以SO3Na 或COOH形式出现的叫做阳离子交换基；带有N（C2H5）基团通常以N（C2H5）Cl出现的叫做阴离子交换基。3 离
6、子交换层析阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素时刻要记住时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所 以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。当pI pH时，蛋白质带净正电荷。举一例子：举一例子：已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，
7、蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。阳 离 子 交 换 层 析 过 程离子交 换树脂蛋白质 高离子 强度洗 脱液洗高离子 强度洗 脱液洗加 样平 衡 液 洗收集依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶
8、剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。4 亲和层析含配体溶液收集目的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样 品平衡液带有配体的树脂 珠（或胶粒）亲和层析过程his- tag所用层析凝胶的基质 上连接了一个NTA（ =nitrilotriacetic acid氮基三 乙酸），可以与Ni离子结合， 而Ni离子与融合蛋白的6Xhis 氨基酸之间产生如图的吸引力 ，从而将带有his-tag组氨酸标 签的融合 蛋白与其它蛋白区 分开来。 从图中可以看到，组氨酸残基 红色五元咪唑环是蛋白与Ni离 子作用的关键。 因此带暴露的His-6的蛋白能 结合于固化Ni树脂，用适当缓 冲溶
9、液冲洗去其他蛋白后，再 用可溶的竞争性螯合剂洗脱可 以回收靶蛋白。电泳v 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。电 泳 技 术 分 类 垂
10、直板电泳毛细管电泳水平板电泳电 泳 支 持 物滤纸凝胶薄膜圆盘电泳SDSPAGE测测定相对对分子质质量十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基 极性亲水烷基 亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键研究背景精氨酸激酶的简介无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中 的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转 移酶E.C.2.7.3.3）， 是细胞代谢中的磷酸激酶，它将 Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和 Mg
11、2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用 。AK在 体内催化反应方程式如下：主要实验仪器紫外分光光度计U4300，电脑恒温层析柜、 ORION pH计 、 紫外检测仪、冷冻离心机、 超声破壁仪 、雪山制冰机、 超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、 单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅实验内容1 活化菌种取50 L表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青 霉素，其工作浓度为50 g/mL）中，于37 摇床振荡培 养8-12小时。 2 扩大培养 将试管中活化的3 mL菌液接种到100 mL LB培养基，同 时加入卡那青霉素（终浓度50 g/mL）培养基于
12、37恒温 培养箱中培养2-3 小时。3 IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加 入 IPTG诱导表达发现，当温度为22 ，OD=0.6-0.8时 ，IPTG终浓度为0.5 mM时AK的表达量达到最大。4 蛋白质提取 （1）将上述各管于4 ，5000 r/m离心10分钟； （2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g 沉淀加5 mL裂解 液； （3）在冰上进行10分钟，间隔为2秒钟的超声波破壁,直 到沉淀变得澄清为止； （4）于4 ，12000 rpm，离心10分钟，取上清，得到 AK的粗提液。5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白预处理： (1)用2 M盐酸胍
13、10 mL与树脂打散混合洗涤； (2)用Stripping Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟； (3)1.5 M盐酸胍洗30分钟，蒸馏水洗30分钟； (4)用1 M NaOH洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏 水洗30分钟； (5)用1.5 M NaCl洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸 馏水洗30分钟； (6)Ni柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗（穿流液 无色）Binding Buffer平衡。 平衡：6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡。上样：插A280滤光片，调A值（0）、T值（100）；打开
14、采集 器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。 将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min。洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗 。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（20 mM 、40 mM、80 mM、100 mM、150 mM）洗脱。在280 nm处进行 连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值 的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯 化程度。 6 AK的检测 SDS-PAGE电泳： （1）安装双垂直板电泳槽； （2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL； （3）制样：取样品20 L与
15、样品缓冲液10 L混合，100 加热5分钟； （4）上样：用微量注射器加样15-20 L （5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后 将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部； （6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几 分钟； （7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板 呈现淡蓝色。酶活力及浓度测定采用改进的方法测定精氨酸激酶的活性，这 个反应体系含有5.7 mM精氨酸，4.8 mM ATP, 6.6 mM 乙酸镁，复合酸碱指示剂(麝香草酚蓝一甲基红)，20 mMTris-Cl，pH 8.2。反应底物溶液25 预热10分钟 。测定活力是将1 ml反应液加入光径1 cm容积为3 ml 的塑料比色杯中，加入10 L酶AK启动反应，测定575 nm处光吸收值在60秒之内的变化。重组AK的表达与纯化结果图5 纯化的AK经分子排阻层析图谱 6、重组AK的最适温度和最适pH图7 温度和pH对重组AK活力的影响LOGO
