《浙江温岭福立2-氯霉素测定技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浙江温岭福立2-氯霉素测定技术（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、氯霉素测定技术背景n2002年3月:泰国、越南、印尼、印度、孟加拉;77个样 品中有16个含量超标n我国出口荷兰、法国等欧盟国家的乳制品等已被销毁 或退回，欧盟及北美等发达国家加强进口商品的检测 。 n美国和加拿大不容许氯霉素用于最终为人类食用的动 物身上；仅批准用于宠养动物疾病的治疗，如猫、狗 和马 n欧盟的96/23(EEC)指令中把氯霉素列入禁用药 :氯霉素类药物是A类禁用药n日本规定所有最终为人类所食用的动物源性食品中氯 霉素残留的容许量必须为零。 氯霉素分析n氯霉素类：别名左霉素，氯胺苯醇。 n化学结构 n毒理学n药物(代谢)动力学n兽医上禁止使用n代谢物n化学结构n测定方法n提取和
2、净化n分析: GC/MS-MS等 氯霉素的化学结构n n 化学名:2,2-二氯-N-2-羟基-1-(羟甲基)-2-(4-硝基苯基) -乙基乙酰胺CAS编码56-75-7。分子式：C11H12O5N2Cl2 分子量：323.14; 药理作用和用途 nCAP是第一个广谱抗生素药，有广谱抑菌作用，对革兰 氏阳性、阴性菌均有抑制作用，尤其对伤寒、副伤寒 杆菌作用更强。其次为大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆 菌、流感杆菌和百日咳杆菌等，广泛用于临床医学及 兽医方面的细菌性感染疾病的控制和治疗，应用至今 已有40年的历史。n氯霉素的抗菌作用通过在生物体内将硝基还原成亚硝 基，而后亚硝基不可逆地同线粒体细胞结合，
3、抑制了 细菌细胞壁形成所必需的蛋白质的合成。苯环对位上 的硝基可增强这类“苯醇类”物质的抗菌作用。作为 兽药,CAP最常被作为兽医用的治疗和预防用药,经口服 后很快就被吸收。低计量时，CAP表现为抑菌作用。 杀菌活性出线在较高剂量时。 用法及用量 n混饲：每1000公斤饲料，鸡预防用100-300克 ，治疗用500-1000克；n混饮：每升水，鸡预防用100-300毫克，治疗 用500毫克。n内服：一次量，每公斤体重，犊牛、狗、猫10 -20毫克，每日二次。n静脉、肌肉或皮下注射：一次量，每公斤体重 ，禽20-50毫克；猪、羊10-20毫克；狗、猫20 毫克，每日二次。 毒理学n氯霉素主要毒性
4、反应是抑制骨髓造血机能，可 引起粒细胞及血小板减少及再生障碍性贫血。 口服有恶心、厌食、腹胀、腹泻等胃肠道反应 。n目前一些国家和地区，还把氯霉素作为一种畜 用饲料添加剂和动物疾病的治疗用药，这样必 然会造成动物肌肉、内脏和乳汁中的残留，直 接或间接威胁人类的健康。为此世界各国纷纷 在临床上已严格控制使用。 药物(代谢)动力学n通过用同位素示踪的的方法研究。发现 CAP排泄的主要途经是:粪便（64.3%）; 尿(16.0%),n代谢:除了未经变化的CAP,有CAP-葡糖苷 酸、CAP-碱、CAP-乙醇、CAP-草氨酸、 CAP-乙酰芳基胺等。 氯霉素n高稳定性n较长的残留时间n当母体化合物残留
5、量降到检测线以下,其 与蛋白质结合的代谢物仍然能检测到 氯霉素测定技术n1) HPLC法n a.色谱柱:通常用C18柱或C8柱。n b.流动相：通常用甲醇-水；0.01M乙酸 钠缓冲液(PH4.3)-乙腈。n c.UV测定波长：有280;278;270和285nm 等。nHPLC法测定低限较差。一般在10ppb 氯霉素测定技术n2）HPLC/MS法n HPLC条件如上，n 费用昂贵。n HPLC/MS/MS检测，测定低限一般在 0.1ppb。 氯霉素测定技术n3) GC法nGC法包括GC-ECD法和GC-MS法。在用 GC法测定时，要将CAP衍生化。n由于硅烷化条件不同，可生成不同的产 物，为
6、了提高硅烷化程度，一般用： BSTFA99%+1%TMS; 氯霉素测定技术n4) ELISA法（酶联免疫法）n国外已有商品试剂合供应市场。n只限于样品筛选。 氯霉素检测特点n沸点高n极性强n质谱的背景噪音高衍生化衍生化的作用在GCMS方法分析样品时，对羟基、胺基、羧基等官能团进 行衍生化有十分重要的作用，主要表现在： 改善样品的气相色谱性质。如羟基、羧基等气相色谱特性不 好。 改善样品的热稳定性。 改善样品的分子质量。分子量增大，有利于样品与基质的分 离。 改善样品的质谱行为。 引入卤素或吸电子基团，是样品可用CI检测，提高灵敏度。 分离手性化合物。GC-MS方法中常用的衍生化方法 硅烷化(s
7、ilylation) 酰化(acylation) 烷基化(alkylation)判断衍生化反应的指标 反应是否迅速、定量进行，反应重复性好坏，反 应条件是否温和，是否容易操作。 反应选择性高，最好只于目标化合物反应。 衍生化产物只有一种，反应的副产物和过量的衍 生化试剂应不干扰目标化合物的分离和检测。 衍生化试剂通用性好，价廉易得。衍生化方法应用不当的弊端 柱上衍生化可能损伤色谱柱。 某些衍生化试剂需氮气吹干。 衍生化不完全，影响灵敏度。 衍生化试剂不当，产物分子量过大。总之，GCMS检测中选用衍生化试剂时，除了和气相色谱 法相同的准则外，还应注意衍生物的质谱特性：质量碎片 特征性强，分子量适
8、中，适合质量型检测器检测，有利于 与基质干扰物的分离。硅烷化衍生化方法是气相色谱 样品处理中应用最多的方法， 它是利用质子性化合物（如醇 、酚、酸、胺、硫醇等）与硅 烷化试剂反应，形成挥发性的 硅烷化衍生物。常用的硅烷化试剂硅烷化试剂中的烷基硅烷基和反应物中的羟基或胺基上的氢 发生交换，形成烷基硅烷基产物。常用的硅烷化试剂有： N，O双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和N，O双三 甲基硅基乙酰胺（BTA）：能衍生化胺基和羟基。常用于体 内药物及其代谢物的检测。 N甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA）：常 用于药物、类固醇的检测。由于叔丁基二甲基硅基有较大的 空间效应，有些胺基较难
9、衍生化。在质谱检测中，该衍生物 很容易失去叔丁基形成较强的(M-57)+离子，有利于作为MS- MS的母离子。 N甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）：最常用的硅烷 化试剂之一。衍生化也是引入三甲基硅基。硅烷化的技术要点常用的硅烷化试剂的一般衍生化条件：在吹干的提取物残渣中加入100l的MSTFA或 BSTFA，加入50 l的吡啶或乙腈，或用事先配好 的衍生化试剂中加催化剂（三甲基碘硅烷TMSI或 三甲基氯硅烷TMSCI）和抗氧剂（硫代赤藓糖醇 ）。衍生化小瓶加盖后在60oC衍生化530min，或微 波衍生化23min，视不同化合物而定。残渣吹干水分对衍生化十分关键。因为衍生化试 剂MSTF
10、A和BSTFA遇水立即分解。衍生化氯霉素衍生物技术发展趋势 n1）开发高灵敏的检测方法的研究，降低测定 检测限；n2）利用新的如：GC/NCI，GC/MS/MS、 HPLC/MS、HPLC/MS/MS技术提高定性能力；n3）建立快速、灵敏的筛选方法： ELISA试剂 合的开发：n4）建立适用于不同机体的灵敏度高、定性能 力强的测定方法。 氯霉素衍生物NCI全扫描及EI/MS/MS比较质谱图较大的化学噪生，且离子丰度不稳定 。无化学噪生，离子丰度比稳定负离子化学电离na. 先产生非常柔性 ( 校正曲线n空白样品n测定样品n检测限: 0.1 g/kgGC/MS/MS测定氯霉素BSTFA衍生物优异的线形范围
