基因病的诊断总

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1、单基因病的诊断中南大学 医学遗传学国家重点实验室 薛晋杰 1bp1Kb 2Mb 6Mb 100Mb亚带、带、区、臂 整条、整组染色体基因疾病基因组疾病染色体疾病基因病诊断高技术平台基因组疾病诊断高技术平台染色体病诊断高技术平台以PCR加DNA测序 为基础，共由 10余项技术组成 。以SNP array加Bac克隆原 位杂交（FISH）技术为 基础，共由10余项技术组成。以染色体G显带技术加染色体 原位杂交技术（FISH）为基础， 共由20余项技术组成。概 述 单基因病 ：指由于单个基因的突变而引起的遗传 病，其遗传方式符合孟德尔定律。 人类大约有3万个基因，目前约有2000个单基因病的致病基因

2、被鉴定。 基因诊断： 利用分子遗传学技术在DNA或RNA水平上对某一基因进行突变分析，从而对特定的疾病进行诊断。 多数单基因病目前尚无有效的治疗。 对于一些严重的单基因病可通过基因诊断和产前诊断的方法，避免再生育患儿。 假性肥大型肌营养不良 脊髓性肌肉萎缩症 非综合征性耳聋 脆性X综合征假性肥大型肌营养不良DMD疾病介绍 Duchenne muscular dystrophy （DMD）假肥大型（进行性）肌营养不良杜氏肌营养不良 儿童最常见的致死性肌肉疾病 遗传方式：X连锁隐性遗传 发病率：1/3500 活产男婴DMD临床特征 35岁隐袭起病，病情进行性加重，9 12岁 不能行走，多于20岁左

3、右死亡。 学步较晚，不愿意行走或跑、行走缓慢，活力 下降、易于跌倒、不能跳跃、上楼困难。 90%有肌肉假性肥大，腓肠肌最明显，触之坚 韧。 鸭步：骨盆带肌肉无力。 Gower征：自仰卧位起立时，先翻身转为俯卧 位，屈膝、髋关节，用手按压膝部以辅助股四 头肌的肌力，双手攀附下肢缓慢地站立。 肩胛带肌受累松弛，呈游离肩；前锯肌和斜方肌萎 缩无力，两臂前推或上举时，肩胛骨呈翼状竖立于 背部，称翼状肩。 大多数伴心肌损害，少数可出现充血性心力衰竭。 30%患儿有不同程度的智力障碍。 腱反射减弱，直至消失 肌酶：CK等活性明显升高 肌电图：肌源性损伤 免疫组化：蛋白消失或减少。 晚期多因呼吸道感染，心力

4、衰竭死亡。 BMD：贝氏肌营养不良，临床特征同DMD，发病 年龄较晚，进展缓慢，病情较轻，存活期长。DMD基因 定位： 位于Xp21 结构： 全长2.5Mb，是人类最大基因； cDNA长14Kb，含 79个外显子。 功能：表达 dystrophin蛋白，具有细胞支 架、抗牵拉、防止细胞膜在收缩活动时 撕裂。 突变类型： 缺失型：6065%； 点突变 和微缺失：30%；重复型突变： 5%发病机制DMD基因 dystrophin蛋白 与肌膜上的其他蛋白形成DAPC复合体 在细胞外基质和细胞骨架蛋白之间形成一个跨膜结构 保护肌纤维和肌膜在长期的反复机械收缩过程中免受损伤和坏死DMD基因检测方法 18

5、个外显子的多重PCR技术 连锁分析单体型分析 胎儿性别鉴定 变性高效液相色谱DHPLC 基因测序多重PCR技术 多重PCR（ mPCR）在一个PCR体系中由多对不同的引物同时 扩增多个不同的DNA片断。 DMD基因两组9重PCR A组：4、8、17、19、44、45、48、51、60 号外显子B组：Pm 、3、6、12、13、43、47、50、52号外显子 突变检出率：60%左右。mPCR 反应体系试剂试剂 （Reagents）体积积（Volume）10Buffer1 lMgCl21 ldNTPs(10 mM)0.3 lGold Taq（5 U/l）0.15lPrimers (100ng/l）

6、2.5lDNA模板 (30 ng/l)0.7lddH2O 4.35lmPCR 反应条件连锁分析 目的：检测携带者非缺失型的产前诊断与mPCR联合分析 方法：在DMD基因内部及下游200kb范围选择11个杂合度较高的微卫星 （STR）位点，进行单体型分析11个微卫星位点详细情况 Marker名称等位基因5CA123452CA123457CA1234544CA1234545CA1234549CA1234550CA1234559CA1234563CA1234579 CA123453CA12345 PCR产物进行变性 聚丙烯酰胺凝胶电 泳 银染显色 各重复片断存在多 种形式 长度最小的重复片 段命名为

7、1 依此类推 注意：基因内部的交换重组胎儿性别鉴定 原理：检测性别决定基因SRY 方法：两重PCR扩增SRY、DMD6号外显 子（内对照） 分析：SRY基因和内对照均有产物为男性有内对照产物而无SRY产物为女性DHPLC技术 变性高效液相色谱 （Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC） 是一种用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链，从而高通量筛选 DNA序列变异的技术， 其专利产品为WAVE DNA片段分析系统。DHPLC的核心组成 分离柱无孔多苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球体疏水，电中性 三乙基铵醋酸盐（TEAA）离

8、子对试剂，其疏水基团与分离柱的疏水基 团发生反应,正电荷与核酸主链上的磷酸基 团的负电荷反应 乙腈将核酸从TEAA上洗脱下来，其浓度越大洗脱 立力越强点突变和携带者的DHPLC检测原理： 突变型与野生型DNA杂交形成异源双链和同源双链 异源双链和同源双链在某一温度下解链的程度不同所以与分离柱的结合力不同 随着乙腈浓度的增高异源双链和同源双链将先后从分离柱上洗脱下来 用紫外分光仪检测洗脱液浓度的连续变化，形成异源双峰检测步骤 PCR扩增DMD基因上的86个片段 各片段的PCR产物分别与相应的野生型PCR产物1：1混合杂交 上样检测 对于有异源双峰的片断进行测序41号外显子 A患者，B母亲，C大姐

9、，D 二姐MLPA 多重连接探针扩增技术(Multiplex ligation- dependent probe amplification ,MLPA) MLPA是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。这一 技术最先于2002年由荷兰的 Schouten JP等报道。 公司试剂盒，可以对DMD基因的79个外显子进行缺失和重复检测。DNA模板MLPA原理扩增产物经毛细管电泳后，扫描图软件分析：经正常对照标化后的柱形图。DMD遗传咨询 DMD为X连锁隐性遗传病，女性携带者，所生 男孩有50%为患儿，所生女孩有50%为携带者。 女性携带者中约8%可表现有轻重不同的症状， 且有

10、较高患扩张性心脏病的风险。 先证者的母亲有2/3的可能为携带者。 母亲外周血中未检出致病基因：1、先证者为新 发突变；2、母亲为生殖腺嵌合体（1520%） 。 有DMD家族史或曾生育患儿的女性再生育时须 行DMD产前诊断。脊髓性肌肉萎缩症脊髓性肌肉萎缩症 SMA 由于脊髓前角细胞运动神经元变性导致近端肌肉萎缩和无力 发病率1/10000 遗传方式：常染色体隐性遗传临床特征 婴儿期学龄前及青春期发病 表现为四肢的近端肌肉对称性进行性无力及萎缩 肌张力降低，腱反射减退或消失 呼吸衰竭 肌电图:神经元性损害 肌酶学检测:多为正常临床类型发病机制SMN基因 定位：5q11.2-11.3。 结构：长20

11、kb，8个外显子， 突变：98.7%为外显子7和/或8的缺失2.3%为点突变与缺失相结合的杂合子PCR-酶切法检测SMN基因原理: SMN2的7、8号外显子分别存在一个DraI 和DdeI酶切位点，而SMN1 没有 其PCR产物进行酶切后可以检测SMN1是否有7、8号外显子的缺失PCR反应体系7号外显子PCR反应条件8号外显子PCR反应条件PCR产物酶切体系及条件测 序 对SMN基因EXON7、8进行直接测序 可确证PCR-酶切法的检测结果 可避免PCR-酶切法酶切不全造成的假阴性结果非综合征型耳聋耳聋简介 听力丧失是最常见的感觉障碍。 发病率：1/500 新生儿 非综合征型耳聋(nonsyn

12、dromic hearing loss, NSHL)：指不伴有耳外组织异常或 病变的耳聋。 遗传方式：常隐、常显、X连锁、线粒 体遗传耳聋相关基因 已经定位120多个 NSHL基因位点 。 克隆确认了41个核基因 。 线粒体基因2个。 最常见的致病基因：GJB2 、SLC26A4 、mtDNA A1555G 1998年夏家辉院士等成功地克隆了人类遗传性耳聋（GJB3）疾病基因。 中国本土克隆的第一个基因。 Nature Genetics volume 20 december 1998, P370-373. Mutations in the gene encoding gap junction

13、protein -3 associated with autosomal dominant hearing impairment GJB2基因 定位于13q11,gDNA长5510 bp,含有2个外显子，只有2号外显子参与编码,编码区长681bp GJB2基因编码产物为间隙连接蛋白分子26（ connexin 26，CX26） CX26在细胞与细胞间形成间隙连接，在感觉毛细胞受到声音的刺激后钾离子回流到内淋巴液的过 程中起着重要的作用。检测方法：PCR+测序 目前已报道的致病突变有191种。 其中235delc为最常见的突变形式，占75%SLC26A4基因 定位于7q31，gDNA长约57kb

14、,由21个外显子组成，编码序列长2343bp。 SLC26A4基因编码pendrin蛋白，为膜蛋白分子，介导阴离子转运。 pendrin蛋白在耳内主要表达于内淋巴导水管及内淋巴囊，球囊和椭圆囊，耳蜗内的外侧沟，参与维持内耳的离子浓度。 检测方法：对21个外显子直接测序药物性耳聋已知的耳毒性药物有近百种 氨基甙类抗生素（链霉素、卡那霉素、新霉素、 庆大霉素等），最为常见。 大环内酯类抗生素（红霉素等） 抗癌药（长春新碱、2硝基咪唑、顺氯氨铂） 水杨酸类解热镇痛药（阿司匹林等） 抗疟药（奎宁、氯奎等） 袢利尿剂（速尿、利尿酸） 抗肝素化制剂（保兰勃林） 铊化物制剂（反应停）线粒体12SrRNA基因

15、 在线粒体基因突变导致耳聋的患者中，绝大部 分是由于A1555G突变引起。 检测方法：PCR+测序引物名称 引物序列12SrRNA-F CCTCAACAGTTAAATCAAC12SrRNA-R CTCTGGTTCGTCCAAGTG脆性X综合征 脆性X综合征（fragile X syndrome），是最常见 的X连锁的单基因性智力低下综合征。 1969年美国Lubs在X连锁智力低下的家系中，发 现带有一条长臂末端具随体样结构的X染色体， 1977年澳大利亚Sutherland将这种随体样结构定 位于Xq27，并命名为脆性部位（fragile site）， 脆性X综合征因此得名。 发病率仅次于21-三体综合征 群体发病率：男性全突变率 1：36004000，女性全突变率 1：40006000FXS临床特征 智力障碍 男性患者大多数都表现为中度至重度智力障，这与甲基化嵌合体及前突变/全突变嵌合体有关约有30%-50%的女性全突变携带者患病，大多数表现为难以觉察的或轻度的智力障碍，女性全突变携带者是否患病及患者智力障碍的差异是由于X染色体差异性失活所致。 特殊面容颜面瘦长、前额突出 、耳朵大 、下颌大 、嘴大 唇厚、上门齿长 腭弓高 头围大 大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸 语言障碍