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1、Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 工 程 Enzyme Engineering第第 六六 课课酶酶 和和 细细 胞胞 的的 固固 定定 化化ImmobilizedImmobilized Enzyme and CellEnzyme and CellEnzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述问题的提出：游离酶的不足之处酶的稳定性问题在温度、pH 和无机离子等外界因素的影响下，酶的稳定性不佳 ，半衰期较短，容易变性失活酶的重复使用的问题在均相体系中的酶催化反应，反应结束后，即使仍有较高酶
2、活力 ，也难以回收利用，成本较高，不便连续化生产产物分离纯化的问题酶反应后成为杂质与产物混在一起，增加分离纯化的困难，尤其 是大分子产物Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述游离酶的改进思路设计一种方法，将酶束缚于特殊的相（固定化），使它与整体 分开，但仍能进行底物和效应物的分子交换固定化酶（Immobilized enzyme）固定在一定载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶固定化酶可像一般化学反应中的固体催化剂一样，既有酶催化 特性，又有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，可使生 产工艺连续化、自动化固定化
3、酶克服游离酶的不足之处，增加酶的稳定性，使昂贵的 酶能重复使用Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述固定化生物催化剂固定化酶固定化死细胞（微生物菌体）固定化活细胞（增殖细胞）固定化植物细胞固定化动物细胞固定化原生质体固定化酶是一个广义的概念！Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述固定化酶的优点提高酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效率，降低成本易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺酶反应过程可严格控制较游离酶更适合多酶反应增加产物
4、收率，提高产物质量固定化酶的缺点固定化时酶活有损失增加了生产初始成本只能用于可溶性底物且较小分子，催化过程受传质因素的限制胞内产物分离较困难Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述固定化酶的发展简史1916 年，Nelson 和 Griffin（美）发现吸附在骨碳上的蔗糖酶 仍显示催化活力 最早的固定化酶（吸附法）1953 年，Grubhofer 和 Schleith（德）用重氮化聚氨基苯乙烯 树脂固定化水解酶1969 年，千畑一郎（日）采用固定化氨基酰化酶，从 DL-氨 基酸消旋混合物中连续拆分生产 L-氨基酸固定化酶
5、的首次工业规模应用促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来1971 年，第一次国际酶工程会议确定“固定化酶”的统一英文 名称为 Immobilized EnzymeEnzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述固定化酶的发展简史1973 年，日本首次在工业上成功应用固定化 E. coli 菌体中的 天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产 L-天冬氨酸首次报道固定化细胞的应用1976 年，法国用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精1978 年，日本用固定化 B. subtilis 细胞生产淀粉酶固定化细胞产酶的先例1979 年，固定化
6、毛地黄细胞和长春花细胞成功固定化植物细胞技术的突破1982 年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸固定化原生质体技术诞生Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化固定化酶概述固定化酶的专著Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Applications and DesignWritten by Lin-Qiu Cao载体固定化酶 原理、应用 和设计杨晟，袁中一译，化学工业出版社 ，2008Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的
7、 固 定 化本章内容酶的固定化酶的固定化方法固定化酶的性质固定化酶的反应动力学简述固定化酶的应用细胞的固定化细胞固定化方法微生物细胞固定化植物细胞固定化动物细胞固定化原生质体的固定化Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化概念固定化酶（immobilized enzyme）水不溶酶（water insoluble enzyme）固相酶（solid phase enzyme）酶的固定化（enzyme immobilization）制备“固定化酶”的过程，即将酶或菌体与不溶性载体结合的过程固定化采用的酶的类型粗酶，或是提纯后的
8、酶结合在菌体或细胞碎片上的酶 / 酶系（固定化菌体）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化酶制备的原则维持酶的催化 活性及专一性应有利于生产 自动化、连续化应有最小的 空间位阻酶与载体必须 结合牢固 稳定性好 载体具有一定惰性成本尽可能低固定化酶 制备的原则Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法Enzyme En
9、gineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法包埋法物理吸附法离子结合法共价结合法交联法其他方法固定化方法的比较Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 包埋法凝胶包埋法天然凝胶天然多糖及其衍生物特点：条件温和，操作简便，对酶活
10、影响小，强度较差合成凝胶合成聚合物材料，如聚丙烯酰胺特点：强度高，对环境的耐受性好，但要依靠聚合反应进行 包埋，酶活有一定损失适用性不适用于底物或产物分子很大的酶的固定化Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋 网格型Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 包埋法半透膜包埋法（微胶囊）微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等，孔径几埃至几十埃，比酶 分子直径小适用性：底物和产物都是小分子的酶微胶囊制备
11、方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而成膜析出界面聚合法：亲水性单体 + 疏水性单体在界面发生聚合二级乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次 级乳化液，而后将聚合物溶液固化脂质体包埋法：类似于“细胞质膜”式的结构聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 包埋法微胶囊制备过程Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 物理吸附法利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附
12、在其表 面上而使其固定的方法是一种可逆的物理方法结合力：依靠分子间力结合，作用力弱，酶 易脱落操作条件：条件温和，酶不发生变性载体材料无机载体：活性炭、多孔玻璃、高岭土、氧 化铝、羟基磷灰石等有机载体：多糖类凝胶、大孔吸附树脂等Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 离子结合法非共价结合法的一种，是通过酶分子与载体 之间的静电引力相结合可以采用填充柱式操作特点静电作用力的强度比范德华力强，因此，通 过离子结合法得到的固定化酶的稳定性好于 物理吸附法结合的酶量具有最大值（饱和性）对 pH 变化较敏感，在高盐条件下
13、不稳定， 酶容易被洗脱Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 离子结合法所用的载体材料一般为合成的离子交换剂阴离子型：DEAE-纤维素 / 葡聚糖、TEAE-纤维素等阳离子型：羧甲基纤维素（CMC）、Dowex 系列阳离子交换树 脂（如 Dowex-50 等）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法通过共价键将酶与载体结合的固定化方法，是载体结合法中报 道最多的方法载体材料的选择天然有机载体多糖（琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶
14、、纤维素、甲壳素等）蛋白质、细胞刚性无机物：玻璃、陶瓷合成聚合物：聚酯、聚酰胺（如聚赖氨酸）、尼龙酶分子中用于共价连接的基团氨基、羧基、巯基、羟基Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法共价结合过程（对照：酶的大分子修饰）载体活化：载体上引入活泼基团偶联：活化后的载体通过活泼基团与酶分子 中的特定基团连接 避免活性中心的基团被偶联共价结合的优点共价结合牢固，酶很难脱落，可长时间使用缺点共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的 催化活性操作较繁琐Enzyme EngineeringEnzyme Engin
15、eering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法载体活化和偶联反应：(1) 含氨基载体Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法载体活化和偶联反应：(2) 含羧基载体（如 CMC）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法载体活化和偶联反应：(2) 含羧基载体（如 CMC）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法载体活化和偶联反应：(3) 含羟基载体（多糖类）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法载体活化和偶联反应：(3) 含羟基载体（多糖类）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶 和 细 胞 的 固 定 化酶的固定化固定化方法 共价结合法载体活化和偶联反应：(4) 含硅无机载体方法一：在载体表面包覆一层有机层（如琼脂糖凝胶、葡聚糖凝 胶、白蛋白等
