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1、考纲解读n1. 微生物的实验室培养n2. 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数n3. 分解纤维素的微生物的分离n4. 细菌的结构和繁殖n5. 病毒的结构和增殖n6. 微生物需要的营养物质及功能n7. 培养基的配制原则n8. 培养基的种类 考点1 微生物的利用一、微生物的实验室培养一、微生物的实验室培养（一）培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称 培养基一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水等培养基的基本成分液体培养基（一般用锥形瓶盛装）固体培养基（一般用试管或培养皿盛装），在液体培养基的基础上再添加琼脂。 培养基的种类2、理解培养基的种类及应用（适当补充）按物理
2、状态不同划分固体培养基液体培养基半固体培养基按化学组成不同划分：合成培养基/天然培养基按用途不同划分鉴别培养基选择培养基加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌只有尿素作为惟一氮源的培养基分离出分解尿素的细菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌只有纤维素作为惟一碳源的培养基 分离分解纤维素的细菌加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞选择培养基做一些适当的补充（二）无菌技术无菌操作泛指在培养微生物的操作中， 所有防止杂菌污染的方法技术。 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵 ，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。灭灭菌方法适用对对象所
3、需条件灭灭菌时间时间灼烧灭烧灭 菌接种金属用具、试试管 口、瓶口在酒精灯火焰的充 分燃烧层烧层 灼烧烧直至烧红烧红干热灭热灭 菌能耐高温并需要保持 干燥的玻璃器皿、金 属用具等干热灭热灭 菌箱内， 160170OC中12h高压压蒸汽 灭灭菌培养基、实验实验 器具等 100kPa，121OC1530min消毒 无菌技术的种类灭菌 使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；将培养皿、接种用具进行灭菌；接种的过程要在酒精灯附近进行。使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。二、实二、实 验验 操操 作作（一
4、）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方 物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至100mL2.基本过程：称量溶化灭菌倒平板 高压锅灭菌冷却到50OC左右时倒基本过程：称量溶化灭菌倒平板 分离分解尿素的细菌：培养基中加入尿素为 唯一氮源 分离分解纤维素的微生物：培养基中加入纤 维素为唯一碳源倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，
5、皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。1.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作 ，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如 教材18页图示）。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉 眼可见的子细胞群体称菌落。
6、优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 缺点：不能计数 一般用于分离微生物的纯种1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼 烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环 ？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀 死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线 时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通 过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少， 以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀 死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 。平板划线法的讨论2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划
7、线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度 的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分 散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操 作和涂布平板操作。优点：可以计数，可以观察菌落特征。 缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不
8、干燥 效果不好，容易蔓延。 一般用于平板培养基的回收率计数 系列稀释操作101102103104105106(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中， 轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试 管中，重复步骤2，直至到第六支试管。涂布平板操作(1)将涂布器浸在盛有70的酒精的烧杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表 面。(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷 却810s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进
9、行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养1224h后进行观察并 记录结果。三、结果分析与评价三、结果分析与评价1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？如果接种成功的话，在培
10、养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大 。4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了 污染。四、课题延伸四、课题延伸菌种的保存菌种的保存1.试管低温临时保存将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔36个月要重新接种培 养后再保存）。2.甘油管长期保存在3
11、mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于20OC的 冷冻箱中保存。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一） 筛 选 菌 株 原理人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养 基。1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素。2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？能分解尿素的细菌的筛选阅读教材
12、22页第一大段相关内容，并思考回答下列问题：有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。（二） 统计菌落数目原理运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的 一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的 关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都 涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30 300的平板进 行计数。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学设置了重复组，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另 2个相差太远，
13、说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重 复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否基本一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。阅读教材22页“（二）统计菌落数目”一段，并讨论教材中提出的问题。（三） 设 置 对 照A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有其它氮源。究竟是哪 个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以 接种其它菌种，看是否有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮 源。另一种方
14、案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行 培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有说服力。阅读教材2223页“（三）设置对照”一段，并讨论教材中提出的问题。一、实一、实 验验 设设 计计阅读教材2325页“实验设计”和“操作提示”等两个内容，请根据教材提供的三个资料、样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图及“操作提示”的有关问题，自行设计一个土壤中分解尿素的细菌的分离与计数这样的一个实验。实验设计1.实验名称土壤中某样品细菌的分离与计数2.实验目的（略）3.材料用具（略）4.操作步骤从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层
15、土3cm左右，再取样，将样品装入事先消毒过的信封中。（1）土壤取样准备牛肉膏蛋白胨培养基（作为对照组）和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数（见教材23页“样品稀释流程示意图”）。稀释倍数为 103 107。每个稀释度均用3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基（都作好标记）。（2）制备培养基 （3）高温消毒 将准备好的培养基和8支试管、一支移液管（用纸包好）放到高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌处理。将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等
16、比稀释至107稀释度，并按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板。（4）微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在30温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选 择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。（5）细菌的计数 选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。二、结果分析与评价二、结果分析与评价1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30
