纸电泳法分离单核苷酸

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1、纸电泳法分离单核苷酸纸电泳法分离单核苷酸实验目的学习电泳技术的基本原理了解RNA碱水解的原理掌握纸电泳分离单核苷酸的原理和方法什么是电泳？带电物质在电场中可以向其所带电荷相反 的电极移动的现象称电泳。电泳分离生物大分子的原理：由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及 分子量的不同，在同一电场的作用下，它们泳动的方 向和速度也不同。因此，在一定时间内各组分移动的 距离不同，从而达到分离和鉴定的目的。 生物大分子在电场中受到的作用力在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质 点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积 。FEQ 质点的前移同样要受到阻力（f ）的影响，对 于一个球形质点，服从S

2、toke定律，即：f6 r （r为质点半径，为缓冲液的粘滞系 数，为质点移动速度）v=EQ /6r 影响V的因素颗粒本身：带电、大小、形状外界因素：电场强度E、缓冲液pH、 离子强度I、电渗、支持介质的筛孔 等。电泳技术的分类自由电泳（无支持体）：等电聚焦电泳、等 速电泳及密度梯度电泳等；区带电泳（有支持体）：滤纸电泳（常压及 高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电 泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝 胶）等。 实验原理 RNARNA的水解的水解RNA在酸、碱和核酸酶的作用下，发生水解，降 解成为多核苷酸和单核苷酸等产物。CMPRNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱 基；用碱水解，经过2、

3、3一环核苷酸中间物 ，可得到2一核苷酸和3一核苷酸的混合 物；用5一磷酸二酯酶或3一磷酸二酯酶水解 则分别可得到3一核苷酸或5一核苷酸。常用的是碱水解：0.5M的KOH在 37作用1624h，即可得到单核 苷酸，再用HCLO4中和，除去K+。环状磷酸二酯实验原理 电泳电泳 碱水解得到的A、U、G、C单核苷酸，是 两性电解质，在一定PH值条件下所带电 荷多少不同，可用纸电泳的方法进行分 离。胞嘧啶核苷酸的解离 pKa1第一磷酸基的pK pKa2碱基含N环的pK四种核苷酸的解离曲线核苷酸磷酸基电 荷氨基的电荷 静电荷AMP-1+0.54-0.46UMP-1+0-1GMP-1+0.05-0.95CM

4、P-1+0.84-0.16UMPGMPAMPCMP试剂试剂试剂试剂和器材和器材1. 电电泳仪仪2. 新华华1号滤纸滤纸3. 毛细细管4. 电电吹风风5. 紫外检测仪检测仪1. A、U、G、C四种 标标准核苷酸2. RNA样样品3. PH3.5柠柠檬酸钠缓钠缓 冲液实验方法 点样点样在距滤纸边缘10cm的地方用铅笔画一直线，两侧各间 隔1.5cm做一个记号（A、U、G、C和RNA），共5点毛细管点样，标准品点4次，RNA样品点8次，在边上点 上一滴苦味酸注意：尽量不要用手接触滤纸，点样直径不超过4mm，点一次 用吹风机热风吹干后再点第二次实验方法2. 电泳将滤纸平整放在电泳槽的塑料架上，纸两端垂于缓冲液 中，用滴管湿润滤纸，最后湿润点样处。点样端接负极，电压600V，电泳大约1h。注意：样品处不要接触塑料架，滤纸上不要有水洼。结果观察取出滤纸，用电吹风热风吹干，在紫外灯下观察结果， 并画出图谱。值日生11和12组