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1、 第三章 碳水化合物的测定Carbohydrates Determination第三节 淀粉的测定v 淀粉的测定淀粉是由葡萄糖聚合成的高分子化合物。淀粉在酶或酸的作用下又水解成葡萄糖，这是淀粉经酶或酸水解后测定还原糖计算淀粉含量的理论基础。另外淀粉经分散和酸解后具有一定的旋光性，则是旋光法测定淀粉含量的基础。本节除介绍经典的酶水解、酸水解而后测还原糖的方法外，还推荐谷物种子粗淀粉测定的国家标准法旋光法。 (一)酸水解法1原理样品经除去脂肪及可溶性糖类后，用稀酸(1HCl)水解淀粉成葡萄糖，按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。该法适用于淀粉含量较高的谷类、薯类，原料测定结果为粗淀粉
2、含量，而其他能被水解为还原糖的多糖含量较少的样品。因为酸水解法不仅是淀粉水解，其他多糖如半纤维素和多缩戊糖等也会被水解为具有还原性的木糖、阿拉伯糖等，使得测定结果偏高。因此，对于淀粉含量较低而半纤维素、多缩戊糖和果胶含量较高的样品不适宜用该法。优点：该法操作简单（沸水浴中水解时间约3-4小时可完成）、应用广泛，普遍采用。缺点：在酸水解淀粉的同时，谷物中的半纤维素和多缩戊糖也随之水解，这样使测定结果产生正误差；选择性和准确性不如酶法。2操作步骤:称干燥样2-3克 乙醚洗涤4-5次.每次10毫升 用10%的乙醇150毫升分次洗涤，以除去糊精等 将残留液用200毫升水流入三角瓶加稀盐酸(1)150毫
3、升至沸水浴溶解3-4h，取出试样少许，检查是否水解完毕（用滴管吸取少量带固体颗粒的溶液，放在白瓷点滴板上，加一滴I2-KI溶液，若不显兰色，红色或紫色说明淀粉已水解完全。否则应继续水解再检查，直至水解完全）冷却用10%NaOH中和逐滴加入中性醋酸铅，以沉淀蛋白质、有机酸、单宁、果胶及其他胶体，必须加热至无沉淀为止。将溶液过滤，收集到250毫升容量瓶中加入饱和硫酸钠，除去剩余的铅（不产生白色沉淀）稀释至刻度 过滤取滤液按还原糖测定法测定葡萄糖含量。蔬菜、水果等样品：按11加水在组织捣碎机中捣成匀浆(蔬菜、水果需先洗净、晾干，取可食部分)。称取510g匀浆(液体样品可直接量取)，于250ml锥形瓶
4、中，其他同上。3注意事项：(1)当脂肪含量低时，可省去乙醚洗涤和脱脂步骤。乙醚也可用石油醚代替。若样品为液体，则采用分液漏斗振荡后，静置分层，去除乙醚层。(2)如果要求测定结果不包括糊精，则用10乙醇洗涤除去可溶性糖类(包括糊精)等物质。(3)根据淀粉的水解反应:把葡萄糖含量折算为淀粉含量的换算系数为:162/1800.9（4） 1HCl，沸水浴中水解，不仅水解淀粉，部分半纤维素和果胶质可部分水解，引起正误差。对于淀粉含量少而半纤维素含量较多的样品影响更大。如草本植物（牧草等）的茎、叶中有较多的半纤维素。种子中虽然淀粉含量高，但也有些五碳聚糖可被酸水解，所以若须取得精确结果，最好采用酶水解法。
5、（5）制备过程中防止酸度的改变。（6）其他操作同还原糖。（二）酶水解法1原理样品经除去脂肪和可溶性糖类后，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解为低分子糊精和麦芽糖，再用盐酸进一步水解为葡萄糖，然后按还原糖测定法测定其含量，并折算成淀粉含量。由于淀粉酶的水解具有专一性，它只水解淀粉而不会水解其他多糖，所以该法不受半纤维素、多缩戊糖、果胶等多糖的干扰，分析结果准确可靠。2.步骤（1） 样品处理： 称取25g样品(含淀粉0.5g左右)，置于铺有折叠滤纸的漏斗内，先用50ml乙醚分5次洗涤以除去脂肪。再用约100mL 85的乙醇分次洗去可溶性糖类。用50mL水将残渣移至250mL烧杯中。(2) 酶水解： 将烧
6、杯置沸水浴上加热15min，使淀粉糊化，冷却至60以下，加入20m10.5淀粉酶溶液，在5560保温1h，并不时搅拌。取1滴此液于白色点滴板上，加l滴碘液应不呈蓝色，若呈蓝色，再加热糊化，冷却至60以下，再加20ml 0.5淀粉酶溶液，继续保温，直至酶解液加碘液后不呈蓝色为止。加热至沸使酶失活，冷却后移入250ml容量瓶中，加水定容。混匀后过滤，弃去初滤液，收集滤液备用。(3) 酸水解： 取50mL上述滤液于250mL锥形瓶中，加5ml6molL盐酸溶液，装上回流装置，在沸水浴中回流1h，冷却后加2滴甲基红指示剂（pH4.4红-6.2黄），用20氢氧化钠溶液中和至红色刚好消失。把溶液移入l00
7、mL容量瓶中，洗涤锥形瓶，洗液并入100mL容量瓶中，加水定容，摇匀，供测定用。(4)测定： 按还原糖测定法的高锰酸钾法或直接滴定法进行。同时取50ml 水及与样品处理时相同量的淀粉酶溶液，按同一方法做试剂空白试验。3.注意事项：（1）需时较长，特别是淀粉含量高的样品。（2）温度高于55，若到70-75，酶活性大大降低，或是完全失去作用，因此保温温度必须严格控制。（3）保温时间依样品种类而异，有的样品如马铃薯淀粉的酶水解可延至5昼夜。（4）若用氰化盐碘量法测还原糖，含量0.05-3mg/ml为宜。可按照样品含量调节称样量及分取倍数。（三）CaCl2- HOAc浸提旋光法1.原理：淀粉是多糖聚合
8、物，可用CaCl2- HOAc (=1.3，pH2.3)为分散和液化剂，在一定的酸度和加热条件下，使淀粉溶解和部分酸解，生成一定的水解产物，具有一定的旋光性，可用旋光计测定。用此法时，各种淀粉的水解产物的比旋指定为203。全国谷物淀粉分析方法标准化研究协作组认为，本法结果的重复性好，操作也简便、快速。数显自动旋光仪 WZZ-2A 2.操作步骤（1）样品处理：称取过60目筛的样品2.500g置于250ml三角瓶中，加入10mlCaCl2 - HOAc溶液，摇匀，加几粒玻璃珠使其充分分散。临加热前再加50mlCaCl2 - HOAc溶液，摇匀，加盖小漏斗，立即置于118l恒温甘油浴中，使之在5mi
9、n内达到恒温，再继续加热25min，时间到后立即取出置冷水中迅速冷却。用约30ml蒸馏水将三角瓶中的分散液定量地转入100ml容量瓶中，加1m130硫酸锌溶液摇匀，以沉淀蛋白质，再加入1ml15亚铁氰化钾溶液，摇匀，以消除剩余硫酸锌的干扰（2Zn2 K4Fe(CN)6Zn2Fe(CN)64K 亚铁氰化锌沉淀）。若有气泡，可加几滴无水乙醇消除。用蒸馏水定容，用中速滤纸过滤，弃去初滤液10-15ml，收集其余澄清液待测。3.注意事项：(1) 该法选用氯化钙溶液作为淀粉提取剂，是因为钙与淀粉上的前羟基生成络合物，使它对水具有较高的亲和力，从而在水中易溶解。(2) 水解产物的种类和比例决定了其旋光性能
10、，故须严格控制条件操作。(3) 样品中含有水溶性糖类，须先用80乙醇洗糖。但绝大多数谷物种子中水溶性糖含量甚微，一般可忽视不计，不必进行脱糖手续。（4）使样品溶解、水解是本法关键，故加热过程中不要搅拌，也不能使样品粘在瓶壁上。浸提加热过程应始终注意保持样品的均匀分散，避免结块，粘底或附着于瓶壁上，以免使结果偏低。试验证明，在加热初期搅拌，淀粉易结块。但在放入甘油浴前必须轻轻摇动，使样品均匀分散和在CaCl2 - HOAc介质中，勿使样品粘在瓶底，必要时可用铲形玻棒将其搅开，加热后使其自然水解，测定结果的重复性较好。(5) 加入CaCl2- HOAc溶液到沸腾的时间应控制在5min左右。(6)
11、CaCl2- HOAc溶液应在放入甘油浴加热前约5min时，才加入，以防样品粘附在瓶底，影响分散效果。 （7）CaCl2 - HOAc溶液的比重及pH值均需准确调整（pH2.3，用酸度计调试），比重过大或过小均不利于样品的均匀分散，而pH过高（pH2.5）则易使分散液粘稠，难于过滤，pH过低（pH1%,应先脱脂。（3）如果要求不太精密，回流冷凝步骤改在电炉上加热。（4）样品细度 (1mm) （否则会影响消化以致使测定结果偏高），加热至沸的方式及沸腾时的工作状况时决定分析结果的主要因素。严格遵守实验条件，特别要掌握样品加酸处理和加碱处理的回流时间，沸腾状态不能过于猛烈，样品不能脱离液体。（5）所
12、用酸、碱、蒸馏水必须为热的，才能有好的水解和洗涤效果。每次洗涤必须洗净，才不致影响后面的结果。（6）所用酸、碱的浓度须准确配制并标定，并保证在这个过程中浓度变化很小或不变化。（7）一些pro含量高的样品，如棉籽粕等，不能用麻布作过滤介质，不能保证留下全部的细小颗粒。（8）准备古氏坩埚时，系将石棉放入水内，使成稀薄的悬浮液，混匀后将约30ml倒入坩埚内，使其中的水自动漏出，再用抽滤瓶抽干，将坩埚取下，用眼向有光处查看，如该坩埚内所铺的石棉无小孔，即可使用，但也不可太厚，以免不易过滤。（9）双试验结果允许差不超过平均值的1，取平均值作为测定结果。测定结果取小数点后第一位。（10）本法是国家标准分析
13、方法。（二）酸性洗涤剂法(ADF)洗涤剂法是60年代初从事饲料营养价值研究的科学家范苏士特首先提出的，所测定结果根据研用洗涤剂的不同称为“中性洗涤纤维”和“酸性洗涤纤维，认为用洗涤纤维指标代替粗纤维指标更适用于评定饲料品质。从事食品科学研究的科学家也认为洗涤纤维更接近于食品中“膳食纤维”的实际含量。洗涤剂法操作较简便、方法可行、误差小。本节介绍酸性洗涤剂法。1.方法原理：利用季铵盐，例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等表面活性剂，在硫酸溶液中加热煮沸，植物样品中的蛋白质、多糖、核酸等成分则可水解、湿润、乳化、分散，而纤维素和木质素则很少变化。然后再过滤、洗涤、烘干，残渣即为酸性洗涤纤维。本法
14、适用于谷物、饲料、牧草、果蔬等植物茎秆、叶、果实以及测定粗脂肪后的任何样品中粗纤维的测定。2.操作步骤： 称取1-2g风干磨细过1mm筛的样品或相当量鲜样，放入回流装置的容器中，加入100m1酸性洗涤剂溶液。加热使之尽快在510min内煮沸。从刚沸时开始计时，加热保持微沸回流60min。 取下回流容器，用事先烘至恒重的玻璃砂芯坩埚过滤，必要时抽滤。 用90100热水反复洗涤残渣，抽滤，将酸性洗涤剂洗净。 再用丙酮洗涤残渣23次，直至滤液无色，抽干丙酮。 将滤器连同残渣置100干燥箱中干燥3h，冷却后称重。3.注意事项（1）抽滤样品酸洗涤液时不要抽气过猛，以免残渣堵塞滤器孔隙。用热水洗涤残渣时，
15、可用玻璃棒轻拌，再浸泡1530S后，开始缓缓抽滤。（2）抽滤时要使每次溶液抽净时再加蒸馏水，洗涤的效果才会好。或改为倾泻法抽滤(?),待酸洗涤完全后再全部抽滤倾泻法抽滤倾泻法抽滤: :当沉淀的比重或结晶颗粒较大时可用倾泻法分离当沉淀的比重或结晶颗粒较大时可用倾泻法分离和洗涤沉淀。方法是静置溶液，使沉淀充分沉降到容和洗涤沉淀。方法是静置溶液，使沉淀充分沉降到容器底部，然后小心地通过玻棒将上层清液倾倒入另一器底部，然后小心地通过玻棒将上层清液倾倒入另一容器中。容器中。（3）此法获得的粗灰分较酸碱洗涤法准确，不必扣除灰分,若要精确计算时，应将灰分除去。用酸性洗涤剂法测得的残留物除了包括全部的纤维素和
16、木质素以外，还包含一些无机物质。（4）煮沸的时间严格控制，并使整个过程保持微沸状态以获得准确的结果。（5）样品中酸洗涤剂纤维25%, 允许差2（6）样品细度为1mm；酸浸时间为1.5h；溶液处在微沸状态下；热水洗涤量为250ml 时，测定结果准确度高、重现性好。（7）过滤时间不应太长，应尽量在10min以内完成。六、果胶物质的测定果胶物质(Pectic Substances)是一种植物胶。 1、可作为食品生产中的胶冻材料和增稠剂。 2、果胶具有预防动脉粥样硬化、在医药上可以作为治疗胃肠道及胃溃疡等疾病的良好药剂，止血剂。 3、消除体内的细菌毒性和铅、汞等重金属及放射性元素等有害物质的毒害作用。 4、对控制饭后血糖的上升也具有辅助作用等。 5、还可以代替琼脂用于化妆品生产等。特别是低甲氧基果胶，因为它能与铅、汞等有害金属形成人体不能吸收的不溶解物，因而可用作金属中毒的一种良好解毒剂和预防剂。美国化学家协会等组织给各种不同
