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1、广东医学院广东医学院20042004级研究生级研究生开题报告开题报告SurvivinSurvivin与鼻咽癌放射残存细胞与鼻咽癌放射残存细胞 Tr-12Tr-12放射抵抗的关系探讨放射抵抗的关系探讨 研究生：研究生： 毕毕 宏宏导导 师：师： 孙孙 宁教授宁教授 时时 间：间： 20052005年年8 8月月2020日日立题依据立题依据立题依据立题依据 放射治疗是鼻咽癌的首选治疗手段，但放放射治疗是鼻咽癌的首选治疗手段，但放 射后射后5 5年生存率较低，局部复发和远处转移年生存率较低，局部复发和远处转移 是放疗失败的原因。是放疗失败的原因。 放射后存活细胞对放射的抵抗是放疗后复放射后存活细胞对
2、放射的抵抗是放疗后复 发和转移的基础。发和转移的基础。 明确放射抵抗的机理可提高放疗的局部控明确放射抵抗的机理可提高放疗的局部控 制率和完全缓解率。制率和完全缓解率。立题依据立题依据研究证明肿瘤细胞对放射的反应主要受基研究证明肿瘤细胞对放射的反应主要受基 因控制因控制在受放射细胞中在受放射细胞中DNADNA链断裂，伴有细胞周链断裂，伴有细胞周 期、生长因子、信号转导、基因表达的改期、生长因子、信号转导、基因表达的改 变变照射存活后代放射抵抗机制可能与：凋亡照射存活后代放射抵抗机制可能与：凋亡 减少减少; ;增殖减慢增殖减慢;DNA;DNA损伤修复能力增强有关损伤修复能力增强有关survivin
3、survivin基因基因 SurvivinSurvivin是是IAPsIAPs家族中分子量最小但抗凋家族中分子量最小但抗凋 亡能力最强而倍受关注的明星分子亡能力最强而倍受关注的明星分子 位于染色体位于染色体17q2517q25，全长，全长15kb15kb，含，含4 4个外个外 显子，显子，3 3个内含子，编码分子量为个内含子，编码分子量为16.5kD16.5kD 的蛋白质的蛋白质 羧基末端缺乏环指结构羧基末端缺乏环指结构 ，氨基端只含有一，氨基端只含有一 个包含保守的个包含保守的Cys/His Cys/His 的的BIRBIR功能区功能区 SurvivinSurvivin的组织分布的组织分布
4、胚胎和胎儿组织中大量表达，胚胎和胎儿组织中大量表达， 分化成熟的正常组织无表达分化成熟的正常组织无表达 特异性地表达于多数肿瘤组织特异性地表达于多数肿瘤组织survivinsurvivin基因的主要功能基因的主要功能 抑制凋亡抑制凋亡 CaspaseCaspase途径：途径：caspase-3/7caspase-3/7 非非caspasecaspase途径：途径：NFBNFBsurvivinsurvivin基因的主要功能基因的主要功能 参与细胞周期调控参与细胞周期调控特异性地表达于特异性地表达于G2/MG2/M期期survivinsurvivin基因的主要功能基因的主要功能 参与血管的生成参与
5、血管的生成 参与参与DNADNA损伤后修复损伤后修复survivinsurvivin参与肿瘤放疗抵抗的机制参与肿瘤放疗抵抗的机制参与放射引起肿瘤细胞参与放射引起肿瘤细胞DNADNA损损 伤修复的调节伤修复的调节survivinsurvivin参与肿瘤放疗抵抗的机制参与肿瘤放疗抵抗的机制阻滞细胞周期于放射不敏感期阻滞细胞周期于放射不敏感期survivinsurvivin参与肿瘤放疗抵抗的机制参与肿瘤放疗抵抗的机制阻止自发性和放射诱导性凋亡阻止自发性和放射诱导性凋亡以以SurvivinSurvivin为靶点的肿瘤放射增敏为靶点的肿瘤放射增敏 SurvivinSurvivin核酶核酶 Pennati
6、Pennati等用靶向等用靶向SurvivinSurvivin的锤头状核酶的锤头状核酶 作用于两个过表达作用于两个过表达SurvivinSurvivin的黑色素瘤细的黑色素瘤细 胞株胞株 ，-射线照射后，与亲代细胞相比，射线照射后，与亲代细胞相比， 表达核酶的细胞克隆形成率下降，表达核酶的细胞克隆形成率下降， caspase-3caspase-3活性提高，凋亡水平增加活性提高，凋亡水平增加 以以SurvivinSurvivin为靶点的肿瘤放射增敏为靶点的肿瘤放射增敏 SurvivinSurvivin反义寡核苷酸反义寡核苷酸 CaoCao等在肺癌小鼠模型中，瞬时转染等在肺癌小鼠模型中，瞬时转染
7、survivinsurvivin与与XIAPXIAP的反义寡核苷酸能显著下的反义寡核苷酸能显著下 调它们的表达，反义治疗联合放疗组的移调它们的表达，反义治疗联合放疗组的移 植瘤出现了超过植瘤出现了超过1515天的生长延迟天的生长延迟 以以SurvivinSurvivin为靶点的肿瘤放射增敏为靶点的肿瘤放射增敏 siRNAsiRNA干扰干扰KapplerKappler等以等以survivin siRNAsurvivin siRNA转染肉瘤细转染肉瘤细 胞，发现胞，发现survivinsurvivin表达明显下降，且肿瘤表达明显下降，且肿瘤 细胞的放射敏感性随照射剂量的增加而增细胞的放射敏感性随照
8、射剂量的增加而增 加。加。姜黄素放射增敏的研究进展姜黄素放射增敏的研究进展姜科姜黄属植物姜黄姜科姜黄属植物姜黄Curcuma longa LCurcuma longa L(C(C domestica Valetdomestica Valet) )是一种常用中药，是一种常用中药， 药用其根茎药用其根茎 抗炎抗氧化抗凝降血脂抗炎抗氧化抗凝降血脂 抗动脉粥样硬化及抗抗动脉粥样硬化及抗 肿瘤肿瘤 姜黄素放射增敏的研究进展姜黄素放射增敏的研究进展我室黄小军、曹璋的实验已证明姜黄素通过我室黄小军、曹璋的实验已证明姜黄素通过 改变细胞周期对鼻咽癌放射抵抗细胞的增改变细胞周期对鼻咽癌放射抵抗细胞的增 敏作用敏
9、作用 创新之处创新之处探讨探讨survivinsurvivin与鼻咽癌细胞放与鼻咽癌细胞放 射抵抗的关系以及姜黄素对射抵抗的关系以及姜黄素对 survivinsurvivin表达的影响，为鼻咽表达的影响，为鼻咽 癌的放射增敏提供理论依据癌的放射增敏提供理论依据 研究目标研究目标研究目标研究目标探讨探讨survivinsurvivin的表达与鼻咽癌细胞放射抵的表达与鼻咽癌细胞放射抵 抗的关系，姜黄素作用对抗的关系，姜黄素作用对survivinsurvivin表达及表达及 放射敏感性的影响，为鼻咽癌预后的判断放射敏感性的影响，为鼻咽癌预后的判断 ，放疗后复发的治疗及放射增敏提供理论，放疗后复发的治
10、疗及放射增敏提供理论 指导指导 研究目标研究目标对比慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状对比慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状 细胞癌及放疗后复发鼻咽癌细胞癌及放疗后复发鼻咽癌 survivinsurvivin及及caspase-3caspase-3蛋白表达，蛋白表达，研究内容研究内容研究内容研究内容 CNE-2ZCNE-2Z及其放射残存细胞及其放射残存细胞tr12tr12的培养。的培养。 分别检测两个细胞株的自发凋亡水平，然分别检测两个细胞株的自发凋亡水平，然 后施以不同剂量后施以不同剂量( (暂定为暂定为2 2、4 4、8 8、10Gy)10Gy) 的照射，培养一定时间后用的照射，培养一定时间后用 hoec
11、hst33342/PIhoechst33342/PI双染法检测凋亡水平；双染法检测凋亡水平； RT-PCRRT-PCR检测检测survivinsurvivin的的mRNAmRNA水平；比色水平；比色 法测法测caspase-3caspase-3的活性变化的活性变化 研究内容研究内容 收集慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状收集慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状 细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本 各各2020例，用例，用MSPMSP法测法测fhitfhit基因甲基因甲 基化是否存在及甲基化率，用免疫基化是否存在及甲基化率，用免疫 组织化学法测组织化学法测PKCPKC的表达。的表达。研究
12、内容研究内容 对对Tr-12Tr-12细胞做姜黄素的细胞毒实验（细胞做姜黄素的细胞毒实验（MTTMTT 法），取低毒性剂量联合照射（不同剂量法），取低毒性剂量联合照射（不同剂量 ）作用于）作用于Tr-12Tr-12细胞，设对照组、单纯加药细胞，设对照组、单纯加药 组、药物联合放射组、单纯放射组。各组组、药物联合放射组、单纯放射组。各组 细胞用克隆形成实验绘制放射细胞用克隆形成实验绘制放射- -存活曲线；存活曲线； RT-PCRRT-PCR检测检测survivinsurvivin的的mRNAmRNA水平，免疫水平，免疫 细胞化学检测细胞化学检测survivinsurvivin和和caspase-
13、3caspase-3的表的表 达达 研究内容研究内容 收集慢性鼻咽炎、鼻咽分化性非角化型鳞收集慢性鼻咽炎、鼻咽分化性非角化型鳞 状细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本各状细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本各3030 例，免疫组化检测例，免疫组化检测survivinsurvivin与与caspase-3caspase-3 蛋白的表达蛋白的表达 技术路线技术路线一、实验病理部分一、实验病理部分CNE-2Z细胞培养Tr-12细胞培养姜黄素细胞毒实验 (MTT)不同剂量照射空白对照组空白对照组不同剂量照射姜黄素加照射姜黄素阈下剂量克隆形成实验 RT-PCR测survivin ,caspase-3mRNA 水平
14、比色法测caspase-3活性 hoechst/PI双染测凋亡水平 免疫细胞化学测survivin caspase-3蛋白 表达 二、临床病理部分二、临床病理部分慢性鼻咽炎鼻咽分化性非角化型 鳞状细胞癌放疗后复发鼻咽癌Survivin蛋白表达 免疫组化Caspase-3蛋白表达 免疫组化拟解决的关键问题拟解决的关键问题 CNE-2ZCNE-2Z及其放射残存细胞及其放射残存细胞tr-12tr-12 的培养。的培养。 放射后复发的鼻咽癌标本的收集放射后复发的鼻咽癌标本的收集 。预期结果预期结果预期结果预期结果 照射前和不同剂量照射后照射前和不同剂量照射后Tr-12Tr-12细胞株中细胞株中 sur
15、vivinsurvivin的表达明显高于的表达明显高于CNE-2ZCNE-2Z； caspase-3caspase-3的活性在的活性在CNE-2ZCNE-2Z中比中比Tr-12Tr-12 中高；中高；hoechst/PIhoechst/PI双染法测凋亡水平在双染法测凋亡水平在 CNE-2ZCNE-2Z中高于中高于Tr-12 Tr-12 预期结果预期结果 姜黄素一定浓度作用于姜黄素一定浓度作用于Tr-12Tr-12后，后，survivinsurvivin的表的表 达低于作用前，照射与姜黄素联合组比单纯照达低于作用前，照射与姜黄素联合组比单纯照 射组的存活分数低，免疫细化显示射组的存活分数低，免疫
16、细化显示survivinsurvivin的的 表达也比单纯照射组低。表达也比单纯照射组低。 慢性鼻咽炎中慢性鼻咽炎中survivinsurvivin表达几乎为零，鼻咽低表达几乎为零，鼻咽低 分化鳞癌中分化鳞癌中survivinsurvivin表达水平低于放疗后复发表达水平低于放疗后复发 的鼻咽癌，的鼻咽癌，caspase-3caspase-3的表达与的表达与survivinsurvivin呈反呈反 相关。相关。经费预算经费预算 细胞培养基本材料及放射费细胞培养基本材料及放射费 20002000元元 caspase-3caspase-3活性检测活性检测 20002000元元 免疫组化试剂免疫组化试剂 20002000元元 hoechst/PIhoechst/PI双染双染 30003000元元
