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1、蒋小英蒋小英 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 西西 安安 交交 通通 大大 学学 医医 学学 部部 基基 础础 医医 学学 院院 第二十五章第二十五章基基 因因 诊诊 断断 和和 基基 因因 治治 疗疗 一、基因诊断的主要对象和样品来源 二、基因诊断的技术技术三、基因诊断的临床应用第一节第一节 基因诊断基因诊断 基因诊断：是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断检测的分子也可以是蛋白质或多肽。一 基因诊断的主要对象和样品来源 基因诊断的内容基因诊断的内容 定性和定量分析基因序列分析基因突变分析基因拷贝数分
2、析基因表达产物分析外源基因检测基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性样品来源：血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液基因诊断的前提已明确疾病表型与基因的关系二二 基因诊断常用的分子生物学技术基因诊断常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断 （ Immunohist
3、ochemistry ）（一）核酸分子杂交（二） PCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用 RT-PCR 荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP1 1）. RT-PCR. RT-PCR指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时PCR( real time PCR)2）. 荧光定量PCRSYBR Green实时定量PCR分析原理示意图 荧光标记引物Livak Comparative Ct Method (2-DDCt) for Relative Quan
4、tification1. Normalize C(t):C(t) = C(t)target - C(t)hskg2. Calculate C(t)Average:C(t)Ave = Average C(t) of replicates 3. Normalize to calibrator: C(t) = C(t)Sample Ave - C(t)Calibrator Ave (For calibrator, C(t) = 0)4. Fold difference:F=2-C(t) = Normalized fold difference (For calibrator, 2-C(t) = 1)
5、相对定量 3 3）. . 多重多重PCRPCR多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR 该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交4）. PCR-ASO Allele specific oligonucleotide,ASO等位基因特异性寡核苷酸分子杂交PCR-ASO N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因ASO1ASO2NHM（三）单链构象多态性分析 （single-strand conformation polymorphism, SSCP）DNA突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链DN
6、A后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。SSCP特别适于分析小于400bp的PCR产物。可以区分1bp的差异。PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，电泳后还需测序分析。PCR-SSCP分析原理示意正常人纯合突变杂合突变+PCR-SSCP分析 （四）限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP）由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内
7、切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLPABCDEFGD E FBGCAGAATTC CTTAAGE FBG C +DAEcoR 限制性内切酶位点的变化（五） DNA序列测定（DNA sequencing）左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究（六）生物芯片（biochips）基因芯片（gene chips）蛋白质芯片(protein chip)（一）.对致病基因的直接诊断清楚基因突变与疾病之间的分子机制（二）.通过连锁遗传标志的间接诊断许多基因病，基因结构未阐明，但已定位在染色体的特定位置上，通过检测与特定染色体
8、位点连锁的遗传标记来诊断。一.对致病基因的直接诊断清楚基因突变与疾病之间的分子机制 1 基因缺失或插入的诊断2 点突变的诊断3 动态突变的诊断4 基因表达异常的诊断一一. .对致病基因的直接诊断对致病基因的直接诊断1 1 基因缺失或插入的诊断基因缺失或插入的诊断 方法Southern杂交斑点杂交原位杂交跨断裂点的PCR(裂口PCR,gap-PCR)Southern印迹检测片段缺失A:正常个体B:缺失纯合子C:缺失杂合子BamHIBamHI21210 kb14 kbprobe-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血缺失片段20kb5/
9、5/3/ 3/RFLP或PCR-RFLP（1）有限制性内切酶位点改变一一. .对致病基因的直接诊断对致病基因的直接诊断2 2 点突变的诊断点突变的诊断前提条件：多数点突变不是酶切位点 主要方法 PCR-ASO （Allele specific oligonucleotide,ASO） 等位基因特异性寡核苷酸分子杂交RDB （Reverse dot blot）反向点杂交DHPLC （Denature high performance liquid chromatography）变性高效液相色谱- PCR-SSCP （ single-strand conformation polymorphism
10、, SSCP）单链构象多态性分析- AS-PCR (Allele specific PCR)等位基因特异PCR ,PCR产物直接测序（2）无限制性酶切位点改变 PCR-ASOPCR-ASO 合成野生型和突变型探针PCR扩增受检者目的DNA片段，与上述探针杂交结果： PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不存在这种突变；只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型正常探针突变探针A 正常B 突变纯合子C 突变杂合子反向点杂交反向点杂交 (reverse dot blot,RDB)(reve
11、rse dot blot,RDB) 将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上,而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交,这种立法称为反向点杂交. 同时检测多种突变，如地中海贫血。囊性纤维化变性高效液相色谱变性高效液相色谱 （denature high performance liquid chromatography, denature high performance liquid chromatography, DHPLCDHPLC ） 利用PCR扩增过程的单链DNA产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性,依据最终产物中是否会出现异源双链来判断待测样品
12、中是否存在点突变.一一. .对致病基因的直接诊断对致病基因的直接诊断3 3 动态突变的诊断动态突变的诊断 短串联重复(STR) 拷贝数的增加导致某些遗传病发生,称为动态突变. 方法:PCR直接扩增诊断基于STR的DNA片段长度多态性 如脆性x染色体综合征;5端CGG重复序列正常人拷贝数5-50症状前携带者50-200患者超过200，片段过长无法扩出mRNA的相对定量分析mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析一一. .对致病基因的直接诊断对致病基因的直接诊断4. 4. 基因表达异常的检测基因表达异常的检测连锁分析(linkage analysis) 利用与致病基因相连的某些基因作为遗传标志,通
13、过鉴定遗传标志的存在与否判断是否带有致病基因.优点 无需更多了解致病基因结构及其分子机制缺点 间接诊断,没有直接检测基因突变二二. .通过连锁遗传标志的间接诊断通过连锁遗传标志的间接诊断1 1 连锁分析的遗传标志连锁分析的遗传标志 特点不同个体之间存在高度的多态性需要获得足够数量的家系成员样本标记基因与致病基因相连锁人类基因组上的人类基因组上的DNADNA遗传标记遗传标记1980 限制性片段长度多态性(RFLPs )1985 短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites )1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleoti
14、de polymor-phisms SNPs)RFLPsRFLPs 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 主要用于一些基因较大且突变类型不清楚的单击因遗传病的诊断。PCR-RFLP7.6kb13kb患 者正 常镰状红细胞贫血的间接基因诊断镰状红细胞贫血的间接基因诊断-珠蛋白珠蛋白RFLPRFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthern印迹杂交N H PN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针HapHapHapSTRsSTRs 短串联重复序列 STR广泛存在于人基因组，总数约有5
15、-10万个，个体之间的STR互不相同，能够稳定遗传基本单位2-4bp的串联重复，主要形式为：(CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ，(CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(AFLP,Amp-FLP)(AFLP,Amp-FLP) 通过PCR技术,扩增致病基因内部或两侧与其紧密连锁的特定STR,经电泳检测扩增片段长度多态性,实现基因诊断的方法.定义:主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 人类基因组有300多万个SNP位点，平均每5001000个碱基对中就有1个。SNPsSNPs 单核苷酸多态性基于基于SNPSNP的单倍型分析的单倍型分析 指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基,其中最少的一种在群体中的频率不小于1%. SNP可以确定个体的疾病易感性和药物反应性. 以SNP单倍型（多位点SNP 分析）为遗传标志，结合家系分析推断疾病.三三 基因诊断的医学应用基因诊断的医学应用（一）遗传性疾病的诊断和风险预测（二）多基因常见病的预测性诊断（三）传染病病
