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1、定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术 及其临床应用卫生部临床检验中心 李金明PCR?PCR只是一个简单的不起眼玩艺凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是： PCR概念变成了可操作的实验系统，变成 了一项成熟的技术，后者又上升成为新的 概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow什么是PCR?我不认为PCR能够用两种“革命”(政治 革命和科学革命)加以说明。它的发明 并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我 们能在更广的范围内更快、更容易地进行 基因操作，
2、学术界也完全不用等到某人死 去或退休后才能接受PCR。它只不过是一 种新工具。凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR及有关技术的发展历史（1）1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。PCR发明过程的简单回顾PCR及有关技术的发展历史（2）1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki 等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim)PCR及有关技术的发展历史（3）1987 当
3、年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术 专利批准。成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公 司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR 试剂产品及第一台热循环仪。1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂 志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度 分子”。Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将 PCR应用于临床诊断 。PCR及有关技术的发展历史（4）1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA
4、多聚酶的方法。第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获 得生化分析奖。1991 TaqMan 技 术 发 表。 当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR 专利权。 Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行 RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。 耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。PCR及有关技术的发展历史（5）1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环 扩增仪等专利； 1993 AMPLICOR HCV*首
5、次用于临床RNA PCR 标 准试剂盒。Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化 学奖。PCR及有关技术的发展历史（6）九十年代中期PCR临床应用在国内全 面展开n1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广 泛的应用于临床检测n1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血 液筛查PCR 循环 第一步 加热变性靶序列靶序列PCR 循环- 第二步 引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2Biotin Biotin53553533PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNA P
6、olymerase第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconPCR扩增过程图
7、示PCR扩增的理论模式PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=Yn-1(1+E) = Yn-2(1+E)2= X(1+E)n 0E1 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增 速率，最终达到平台，不再扩增.影响PCR扩增效率的因素: PCR定 量的困难?n引物/靶的杂交n反应试剂的相对量n样本在扩增仪中的位置的不同n临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在nPCR扩增模板的量n靶核酸链的再退火及酶过量可致E
8、降低 PCR 和定量问题n高浓度/高效率n高浓度/低效率n低浓度/高效率N: 扩增分子的数目n: 扩增循环的次数log-phase analysisNnend-point analysis定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。定量PCR的方法n定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、 动力学方法和内标共扩增方法n定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数 量）和相对定量（即测定不同样本中X的比 率）用外标准的定量PCR方法使用外标的定量PCR方法的优缺点n优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双
9、 孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果， 甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差 异；n缺点：（1）PCR反应体系中小的区别也会对测定 造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异 ，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。n因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法 ，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复 性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。TaqMan实时荧光定量PCR分子信标实时荧光定量PCR动力学定量PCR方法 n第一步：确定PCR扩增的效率；n第二步：根据相应的公式计算原始 模板数。扩增效率的计算(1)n如果在PCR每一个扩增循环中扩增效率为常 数，则可通过在PCR扩增
10、的指数期的数个连 续的或非连续的周期中取扩增样本，然后 测定每份样本中的产物Yn的量来测定E值。 有必要收集2份以上的样本，最好是尽可能 多的样本以确证扩增效率保持恒定；换句 话说，也就是PCR尚未达到扩增效率开始降 低时的阶段。如果取的是连续的样本，则 可从公式（1）测得E值； 扩增效率的计算扩增效率的计算(2)n如果取的样本不连续，则可使用下述将公 式（2）重排后得到的更为通用的公式，用 参数j（取样中间隔的周期数）替代n，Yj（ 在较高循环周期数取样的产物量）替代Yn ，Yi-j（在较低循环周期数取样的产物量） 替代X：n E1（Yi/Yi-j）1/j (3) X(原始模板数)的计算一旦
11、效率确定后，根据公式（4）可从测定的产物量和循环周期数计算得到X。公式（4）来源于公式（2）的重新排列： XYn /(1E)n （4）X的另一种计算方式(1)另一种方式是，根据公式（2）的对数形 式，以所测定的Yn值的对数对函数n绘图得 到X值：logYn = logX + nlog(1+E) (5)当n0时，可在图上读出X值，或通过对 公式（5）的线性回归计算X值（图2）。动力学方法的特点这种方法的优点: (1)不需要外标准；（2）如果能测定PCR产物分子的绝对数量，则可得到待测样本的不同的扩增效率（Ee)。使用非竞争性内标准的定量PCR方法 n非竞争性内标准：（1）一般为与靶核酸无关的基因
12、组 ；（2）既可是内源的也可是外源的；（3）与靶核酸无 相同的引物结合位点和扩增序列。n对于DNA的扩增，非竞争性内标几乎所有的基因都可应 用，最常用的有丙酮酸脱氢酶、前脑啡肽或肌动蛋白 的基因。n而对RNA的扩增，则非竞争性内标较难寻找。理想的 mRNA内标应该在整个细胞周期中表达的水平变化不大 ，此外，其表达水平应接近于靶RNA，而且它们的扩增 效率应相等，因此两者扩增线性区域是重合的。已有许 多的mRNA被尝试用来作为此种内标，如HLA、肌动 蛋白、GPDH和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。以非竞争性内标定量的主要优点n内标的制备简单n复管测定可排除管间差异，并且在一定程度
13、上，可排除样本间的差异。 以非竞争性内标定量的缺点n内标准和靶核酸的逆转录的效率有可能不 同，并且有可能既使针对的是相同的靶核 酸逆转录效率也会有很大差异。因此，使 用这种方法进行RNA的定量PCR测定极为 困难。n在扩增过程中的指数期测定可对原始模板 相对定量，但如果没有验证在一定的扩增 周期内靶核酸和内标有相同的扩增效率， 则不能进行绝对定量。使用竞争性内标准的定量PCR方法 n“竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争 酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是， 与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间 的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够 很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或
14、高效液 相层析等方法区分。n对内标准的修饰方法包括对野生型基因组的点突 变、部份缺失或插入外来顺序等，目前尚无通用 的规则或程序来构建这种内标准。使用竞争性内标准的定量PCR方法n使用竞争性内标既可进行相对定量也可进 行绝对定量。n相对定量具有很好的精密度和重复性。而 绝对定量，关键是要证明竞争性内标和野 生型靶核酸的扩增效率相同。亦可将竞争 性内标置于含已知量的野生型靶核酸的样 本中同时扩增来评价。使用竞争性内标准的定量PCR方法n要定量单份的临床样本，必须进行数管竞 争性PCR测定，每管中靶核酸的量不变，但 改变竞争性内标的量，因为只有当待测靶 核酸与竞争性内标等摩尔量时才能有可靠 的定量
15、。n由于竞争性PCR可排除管间和样本间的差异 ，因此，其可作为准确的PCR定量方法，适 用于绝对定量及含低拷贝数样本的定量。 定量PCR测定的临床应用及 应注意的问题n为什么要做定量测定？n定性和定量测定结果报告上的混淆 。为什么要做定量测定？n用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效 果的动态观察及抗病毒药物的临床研 究；n用于基因表达方面的研究，如特定的 mRNA的定量测定。定量测定的结果报告n定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测 定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未 知病人的确认诊断。n定量测定结果报告：根据所使用的测定方 法的测定范围报告结果，如样本测定结果 高出此范围，则可报告多少，也可对样本 稀释后再检测；如低于此范围，则报告多 少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝 数/ml或阴性。总 结1.定量测定重在定量，即如何改善扩增指数期的线 性及其范围。 2.定量测定的准确性较之测定下限要重要得多。 3.非竞争性内标和竞争性内标对于使用内标的定量 测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应为在 整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而竞争性 内标则应尽可能近似原始待测模板。 4.定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重要 的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理想化 ，以便控制整个扩增，避开扩增“平台期” 。总 结n5.由样本制备（核酸提取）方法所引起的定 量测定的差异
