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1、诺赛基因腺病毒服务2011年7月26日Outline 腺病毒 腺病毒载体 腺病毒载体的应用 Adxsi重组腺病毒载体系统 腺病毒载体的质检 如何使用和操作病毒腺病毒 结构组成 分类 基因组 感染细胞机制 腺病毒细胞转化作用腺病毒的结构组成直径6090nm20面体，无囊膜240个六邻体12个五邻体双链线性DNA基因组分类Haemagglutination:Sub-Group:Types:Oncogenic Potential :Rhesus:Rat:A12, 18, 31HIGH-+ / -B3, 7, 11, 14, 21, 34, 35Weak+-C1, 2, 5, 6None-+ / -D
2、8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39None+ / -+E4None-+ / - F - G40, 41?-+ / -5型腺病毒的基因组结构示意图腺病毒基因组重要组件E1E2E3E45 ITR3 ITRITR：反向末端重复序列E1： 激活其他病毒基因的转录，对细胞基因的转录也有调控作用E2：调节病毒DNA的复制E3：逃避宿主免疫系统对受病毒感染细胞的清除作用E4：与病毒DNA复制，晚期基因表达，RNA剪接和阻止宿主细胞 生物合成等功能有关L1L5：晚期基因主要编码病毒的结构蛋白腺病毒的感染细胞过程 先结合CAR，再结合整合素 内吞作用将腺
3、病毒内化到细胞中并进入溶 酶体 从溶酶体中释放 腺病毒颗粒转位到细胞核 通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内 转录，复制，病毒包装在细胞核中进行。腺病毒的细胞转化作用 E1A蛋白与RB105蛋白作用，55kD的E1B 基因产物与P53作用，这两种复合物的形 成使细胞失去生长控制 19kD的E1B蛋白可能与抑制腺病毒转化细 胞的凋亡有关。 293细胞为Ad5 DNA片段转化的细胞，其 基因组含有腺病毒DNA左端的11。腺病毒载体 腺病毒作为载体的优点 与其他病毒载体比较 腺病毒载体的改造腺病毒作为载体的优点 广泛的细胞感染范围 不整合基因组 非致病的病毒 能得到较高的病毒滴度 容易构建，容易改造
4、不随生殖种系遗传与其他病毒载体比较腺病毒瞬时表达 ，时 间短免疫反应 强不整合 对大多数细 胞几乎达到 100的感 染效率适合肿瘤基因 治疗，或者局 部的基因治疗AAV表达时间 长免疫反应 低整合几 率低不同血清型 对不同细胞 系有不错的 感染效率适合全身给药 的基因治疗研 究，也可以用 于局部的基因 治疗慢病毒稳定表达整合 针对大多数 细胞也能达 到较高的感 染效率稳定细胞株， 转基因动物， 基因治疗腺病毒载体的改造去掉了E1：（由293细胞反式提供） 去掉了E3：与病毒引起的细胞免疫反应相关，不影响病毒成长 可插入约7.5kb的外源DNA片段（insert）腺病毒载体的其他改造 第二代腺病
5、毒（去掉了E2或E4） 第三代腺病毒（几乎去掉了腺病毒所有基 因） Ad5-F35 （5型fiber换成35型fiber） Ad5-F3 （5型fiber换成3型fiber） 溶瘤型腺病毒（保留了E1区部分基因） 条件复制型腺病毒（由条件启动子启动E1 ）腺病毒载体的应用 腺病毒载体应用的领域 腺病毒载体应用过程中的瓶颈腺病毒载体的应用领域 基因转染 蛋白表达 基因治疗 腺病毒疫苗 细胞移植 iPS腺病毒载体应用的瓶颈 病毒靶向性问题 病毒的免疫原性为题Targeting Ad-vetors Genetic modification of viral coat proteins Tumor-s
6、pecific promoters Conjugation with targeting ligands or polymers Eluding Adenoviral Vector Immunity Immunosuppression Immunomodulation serotype switching Use of targeted Ad vectors microencapsulation of Ad vectors use of helper-dependent (HD) Ad vectors development of nonhuman Ad vectorsAdxsi载体系统 腺病
7、毒载体构建流程 Adxsi载体系统特点 与其他载体系统的比较 常用穿梭载体介绍重组腺病毒的构建流程 病毒载体构建 病毒包装，小量扩增 病毒大量扩增及纯化 滴度测定Adxsi载体特点 Ad5型E1、E3缺陷的腺病毒 直接连接的方案（I-Ceu I,I-Sce I双酶切） 重组克隆阳性率高 能包装对细胞有毒性的基因或者对病毒包 装复制扩增等有干扰作用的基因 病毒滴度高与其他载体系统比较 体外直接连接（Clontech公司 Adeno-X系统） 细菌内同源重组（Adeasy系统） 293细胞里面同源重组（本元正阳Admax 系统） 体外同源重组（invitrogen公司， ViralPower系统）
8、常用穿梭载体介绍 各种报告基因的载体 各种标签的载体 诱导表达穿梭载体系统 iPS相关载体系统P2AE2AT2AP2AKLF4TAAP2AKLF4GFPP2AP2AKLF4OCT4TAAP2AKLF4OCT4GFPP2AOCT4E2AMYCSOX2TAAE2ASOX2GFPE2ASOX2CMVT2AE2AMYCSOX2P2AKLF4OCT4TAAE2AMYCSOX2TAAT2AT-easyOCT42A载体构建流程T2AGFPE2ASOX2CMVT2AGFPE2ASOX2P2AKLF4OCT4iPS相关腺病毒载体腺病毒载体的质检 穿梭载体的质量检测-酶切、测序、PCR 病毒载体的质量检测-酶切、
9、测序、PCR 病毒包装过程检测-镜下观察、CPE 病毒的质量检测-滴度测定、PCR、RCA及纯度检测CPE早期CPE晚期滴度测定方法介绍 OD260法 空斑形成法 TCID50法VP,PFU,IU VP：病毒颗粒（viral particle），包括“活” 病毒和“死”病毒，用OD260法测定 PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），梯度稀释法测定 IU：感染单位（infectious unit）， TCID50法测定。OD260法 (OD260) x (viral dilution) x (cuvette dilution) x 1.1 x 1012 =_OPU/
10、mL 只适合测定纯化的腺病毒TCID50法T =10 1 + d ( S - 0.5 ) d = Log 10 of the dilution (= 1 for a ten-fold dilution). S = the sum of ratios (always starting from the first 10-1 dilution)= 1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0 = 6.8 Titer: T=10 1 + 1 ( 6.8 - 0.5 )= 10 7.3(for 100 uL aliquot of virus) T =10 8.3 (equivalent to 2 x
11、 108) TCID50 / mL Ta10bTCID50/mla10b-0.7PFU/ml = 1 x 10 8.3 - 0.7 PFU / mL = 1 x 10 7.6 PFU / mL = 4 x 107 PFU/mL 各种方法比较RCA的定义 复制型腺病毒（replication competent adenoviruses， 简称RCA）：是在用含腺病毒绝大部分基因组的骨架质粒与携带外源基因表达框的穿梭质粒在293细胞或细胞内同源重组产生腺病毒载体的过程中，重组腺病毒的基因组与整合在293基因组上的E1基因同源序列间发生同源重组而产生的。同源重组导致目的基因丢失而被E1区代替。 R
12、CA的特征：在本不支持复制缺陷型腺病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上可复制和扩增，产生细胞病变，并可形成噬斑。 RCA: replication competent, infectious particleIU: replication defective, infectious particlenon-infectious particles腺病毒载体最终制品中的病毒粒子类型VP: all vector particlesRCA 是如何产生的？Homologous overlap between 293-E1 and vector backbone 450 bpE1 in 293 ge
13、nomeE1 in 293 genomeTransgene cassetteE1 from 293 genomeE1 from 293 genome 1100 bp如何检测RCA 细胞法：在不支持复制缺陷型腺病毒载体增殖的 细胞如A549上进行检测，用噬斑形成的数量来反应 制品中RCA的含量。 PCR法：设计针对E1区的引物，可以特异地检出 携带E1A区基因的RCA病毒粒子。如何降低制品中的RCA？ 现在广泛应用的腺病毒重组系统（如AdMAX， AaEasy）都不可避免地会产生RCA。 近来，荷兰一家公司建立了一株新的称为 PERC6的腺病毒包装细胞株，这种细胞基因组 上整合的腺病毒基因成分与
14、腺病毒载体骨架没有 同源区，用这种细胞生产复制缺陷型腺病毒载体 理论上不会产生RCA。 我们能做的就是控制病毒在293细胞中扩增的代 次。如何使用和操作腺病毒 需要注意哪些安全措施？ 如何确定我的细胞是否适合感染？ 什么是MOI，如何测定最适MOI？ 感染细胞的流程 病毒使用过程中的常见问题需要注意哪些安全措施 橡胶手套，口罩，护目镜，安全柜 液体废弃物用84处理过再高压处理 固体废弃物用可高压的袋收集后高压处理什么是MOI？ MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为 感染复数。 传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。 其含义是感染时噬菌体与细菌的数量
15、比值，也就 是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数 量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有 单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后 来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义 是感染时病毒与细胞数量的比值。 如何测定最适MOI？ 要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常 重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效 率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可 预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到 100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞 类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用 量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如AdCMV- -gal 或者 AdCMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病 毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过- gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达 情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表 型变化病毒浓度范围。感染细胞的流程 培养细胞至7080左右进行感染 用2ml含10%FBS血清的培养基稀释病毒 （病毒用量参照最适MOI值） 吸取原来六孔板中培养基的旧的培养基。 加入稀释病毒的培养基。 5CO2培养箱中培养 如果细胞状态不好可以考虑第二天更换培 养液，状
