《硕士研究生课后基因组学章跃陵基因组测序,序列组装,基因鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《硕士研究生课后基因组学章跃陵基因组测序,序列组装,基因鉴定（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Chaper 3 结构基因组学的核心研究技术 基因组测序、序列组装与基因的鉴定n n结构基因组学的核心内容之一是结构基因组学的核心内容之一是基因组基因组 测序测序。随着人类基因组图谱的完成，人。随着人类基因组图谱的完成，人 类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基 因组测序均取得了突破性进展，测序策因组测序均取得了突破性进展，测序策 略的成熟、测序方略的成熟、测序方 法的改进、自动测序法的改进、自动测序 仪的广泛应用、计算机数据分析系统的仪的广泛应用、计算机数据分析系统的 扩展以及测序分析能力的提高，扩展以及测序分析能力的提高， 大大推大大推 进了大规模进了大规模D
2、NADNA测序的进程测序的进程。一、 DNA测序的基本方 法n n链终止法测序链终止法测序n n化学降解法测序化学降解法测序n n自动化测序自动化测序n n非常规非常规DNADNA测序测序1、 链终止法测序(the chain termination method)1 1）基本原理）基本原理: : 1977年Sanger提出了“终止法”。其反应体系包含单链 模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶，分四组进行，每组 按一定比例加入一种2 ，3双脱氧核苷三磷酸，它能随机 掺入合成的DNA链，一旦掺入合成即终止，于是各种不同 大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳， 可从自显影图谱上直接读
3、出DNA序列。2）技术路线与要求制备单链模板将单链 模板与一小段引物退火加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸将4种反应产 物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNAD PCR产生单链DNAA 高酶活性B 无53外切酶活性C 无35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3碳原子连接 的是氢原子,不是羟基2 化学降解法测序（Maxam和Gibert于 1977年发明）1 1）基本原理）基本原理: :在选定的核苷酸碱基中引入化学基团在选定的核苷酸碱基中引入化
4、学基团, , 再用化合物处理再用化合物处理, ,使使DNADNA分子在被修饰的位分子在被修饰的位 置降解置降解. .2）技术路线将双链DNA样品变为单链每个单链单链 的同一方向末端都用放射性同位素 标记标记 ,以便显显示DNA条带带分别别用不同方法处处理,获获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体电电泳,读读取DNA的核苷酸顺顺序先用限制性内切酶把DNA切成10-200bp 的测序材料； 用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5末端上的磷酸； 在5OH端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； 标记片段变性为单链； 用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用 哌啶切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组
5、不同的特 异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段， 产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段； 经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待 测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。 3 3）MaxamMaxam-Gilbert -Gilbert 法所用的化学技术法所用的化学技术碱基特异修饰方法GpH8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键 C+T肼可打开嘧啶环 ,后者重新环化成五元环 后易除去 C1.5mol/L NaCl存在时
6、,可用肼除去胞嘧啶 4组特异反应 测序流程3 自动化测序1）基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不 同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记 红色荧光, ddTTP标记绿色荧光,ddCTP 标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光,. 由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜 色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱 基.2）基本流程3）自动化测序结果4 、非常规测序及未来测序方法1 1）光点测序）光点测序脱氧三磷酸核苷酸脱氧三磷酸核苷酸连接到连接到DNA 3-DNA 3-末端末端时会释时会释 放放1 1个焦磷酸个焦磷酸( (PPiPPi) ,) ,焦磷酸焦磷酸在在磷酸化酶磷酸化酶的作用下转的作
7、用下转 化为化学能化为化学能, ,并发出光亮并发出光亮. .由此由此, ,往反应液中每次只加往反应液中每次只加 入入1 1种核苷酸种核苷酸, ,如加入的核苷酸结合则反应液发出亮如加入的核苷酸结合则反应液发出亮 点点, ,并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类; ;如核苷酸未结合则反应液中如核苷酸未结合则反应液中 的核苷酸酶迅速分解此核苷酸的核苷酸酶迅速分解此核苷酸, ,按此规律来测定按此规律来测定 DNADNA序列序列. .2）单分子测序法(single-molecule seguencing)n单分子测序法是美国Los Alames国家实验室 (LANL )发展的一种通过检测标记在单个分 子上的荧
8、光进行DNA快速测序的方法。模板 DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使不同 的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激 光束(或称激光镊子lasertweezer)夹住标记 的DNA分子，将其置于液流系统，从被固定 的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标 记的核苷酸， 通过单分子荧光探测器检测液 流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信 号顺序确定DNA顺 序。3）DNA芯片测序基本原理基本原理将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, , 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的 位置位置. .待检测的待检测的DNADNA
9、分子与芯片温浴分子与芯片温浴, ,凡是能杂交凡是能杂交 的寡核苷酸都会在确定位置发出信号的寡核苷酸都会在确定位置发出信号, ,然后根据获然后根据获 取的信息将寡核苷酸的顺序进行取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装对比组装, ,拼接成拼接成 完全的完全的DNADNA顺序顺序. .利用基因芯片进行杂交测序的原理n新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅 助激光吸收技术使利用质谱法分析大片段 DNA 成为可能，其中四极离子捕获效果更 好。Fourier转型质谱或飞行时间质谱可 进行极为敏感的进行DNA测序。4) 质谱法(mass spectrometry) 基质辅助激光吸收技术基质辅助激光吸收技术DNA
10、 sequence analysis by MALDI mass SpectrometryFinn Kirpekar，et al, 25542559, Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. ABSTRACT:Conventional DNA sequencing is based on gel electrophoretic separation of the sequencing products. Gel casting and electrophoresis are the time limiting steps, and the gel
11、separation is occasionally imperfect due to aberrant mobility of certain fragments, leading to erroneous sequence determination. Furthermore, illegitimately terminated products frequently cannot be distinguished from correctly terminated ones, a phenomenon that also obscures data interpretation. In
12、the present work the use of MALDI mass spectrometry for sequencing of DNA amplified from clinical samples is implemented. The unambiguous and fast identification of deletions and substitutions in DNA amplified from heterozygous carriers realistically suggest MALDI mass spectrometry as a future alter
13、native to conventional sequencing procedures for high throughput screening for mutations. Unique features of the method are demonstrated by sequencing a DNA fragment that could not be sequenced conventionally because of gel electrophoretic band compression and the presence of multiple non-specific t
14、ermination products. Taking advantage of the accurate mass information provided by MALDI mass spectrometry, the sequence was deduced, and the nature of the non-specific termination could be determined. The method described here increases the fidelity in DNA sequencing, is fast, compatible with stand
15、ard DNA sequencing procedures, and amenable to automation.5）原子探针显微镜测序法(atomic probe microscopy)扫描隧道显微镜（STM）和原子力显微镜（AFM） 的发展使直接检测DNA分子结构成为可能。其中STM是用一个直接大约相当于一个原子大小的导 电探针扫描DNA分子表面，通过检测探针和DNA分子表 面之间形成的隧道电流来确定DNA分子的三维形状。 STM还可分辩单链DNA分子上的单个核苷酸。通过STM 可观察双链DNA分子的双螺旋结构以及单个碱基对。AFM通过检测扫描探针和分子表面间的作用力来确 定分子表面形状
16、。虽然原子探针显微镜为直接描述DNA组成提供了美 好前景，但就目前来说，如何定位DNA分子以便于检测 是一个难题。An overview of current and emerging technologies for genomic sequencing.Neil Hall . J. Exp. Biol., May 2007; 210: 1518 - 1525 nSequencing can be classified into four main strategies: in vitro cloning, in vivo cloning, amplification and mass spectrometry, and single-molecule approaches. nIn vivo cloning followed by Sanger sequencing is the workhorse method of mos
