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1、To study Urumqi Municipality Uighur different caries sensitive children of Streptococcus mutans clinical isolates adhesion , synthesize exopolysaccharides and related gene polymorphism 乌鲁木齐市维吾尔族不同龋敏感儿童变形链 球菌临床分离株黏附、产糖及相关 基因多态性研究12012-2-2711本课题由导师赵今教授的博士后后续基金资助！于一附院临床检验中心及科技楼分子生物学实验室完成！目 录 1.研究背景2.研究
2、内容与方法3.结果4.讨论5.小结6.发表论文7.致谢慢性细菌性、病程长、易忽视心血管疾病神经系统疾病邻组织器官感染性疾病胚胎发育儿童发育不良消化系统疾病泌尿系统疾病牙源性病灶危 害一、研究背景乳牙龋病是儿童口腔常见疾病，严重影响儿童身心发育及健康。我国儿童乳牙患龋率很高，远远超过发达国家。龋病发生的主要原因变形链球菌合成胞外多糖 黏附产酸、耐酸技 术 路 线 图不含糖BHI液体培养基提取全菌DNAPCR-RFLP分析表面蛋白及糖代谢相关基因多态性胞外多糖含量测定24小时生物膜18小时黏附率测定不含糖BHI液体培养基1%糖BHI液体培养基维吾尔族儿童变链菌临床分离株64株复苏、传代、鉴定、增菌
3、高龋组32株无龋组32株整理数据，统计分析二、研究内容与方法主要实验仪器与设备主要实验试剂与培养基研 究 内 容32株源自无龋组（dmft=0）前期分离、鉴定所得的64株变链菌临床分离株实验菌株32株源自高龋组（dmft5）样本含量计算公式 ：指标一 不同龋敏感儿童变链菌黏附能力比较试管内加入菌悬液和液体培养基黏附细菌洗脱法比浊法高龋、无龋组高龋、无龋组 黏附比黏附比指标二 不同黏附能力菌株表面蛋白遗传多态性分析高黏附力组（黏附比35%）19株不同黏附能力 菌株低黏附力组（黏附比20%）13株5 step5 step4 step3 step2 step1 step提取细菌 基因组DNA设计引物
4、目的基因 扩增PCR-RFLP基因多态性分析引物序列表指标三 不同龋敏感儿童变链菌生物膜状态下合成EPS能力的比较WSG蒽酮法生物膜状态WIG 指标四 变链菌不同WIG合成能力菌株糖代谢相关基因遗传多态性的比较实验菌株合成WIG高组（OD值0.35）18株 不同WIG合成 能力菌株合成WIG低组（OD值0.15）12株 基因多态性分析提取细菌 基因组DNASTEP 1设计引物STEP 2目的基因扩增STEP 3PCR-RFLPSTEP 4引物序列表统 计 方 法采用SPSS19.0软件包进行统计分析。其中两组均数比较采用t检验；各组基因型分布采用卡方检验。=0.05时比较差异是否具有统计学意义
5、。三、结 果1. 变链菌复苏、传代2. 高龋及无龋组变链菌玻壁黏附比（%）3.1 DNA定量 抽提变链菌临床株全菌基因组DNA浓度为500-700g/mL，共获得30-50g的纯化基因组DNA。所有实验菌株OD260nm/OD280nm比值均在1.7-1.9之间。说明抽提产物无蛋白质、酚污染。3.2 spaP-a PCR扩增产物电泳结果3.3 PCR-RFLP结果分析内切酶Hae识别5-GG CC-3 ，853bp-856bp处5-AGCC-3片段突变为5-GG CC-3，从而出现了B基因型3.4 spaP-pv,spaP-c PCR扩增产物电泳结果3.5 PCR-RFLP结果分析4. 蒽酮法
6、测定胞外多糖含量回归方程为：y(葡萄糖量)=1.265X（吸光度）-0.2906 经直线回归方程统计分析检验，F=145.083，P=0.000 相关系数r=0.9805.1 gtfB PCR扩增产物电泳结果 5.2 PCR-RFLP结果分析内切酶BsrI 识别5- ACTGGN- 3 ，B基因型1422bp位点碱基由AG，导致1419-1424bp片段由5- ACTAGC- 3突变为5- ACTGGC- 3而产生B基因型5.3 gtfC PCR扩增产物电泳结果5.4 PCR-RFLP结果分析5.5 srV+ PCR扩增产物电泳结果5.6 PCR-RFLP结果分析内切酶Dde 识别5-C TN
7、AG-3 ，B基因型710-714bp片段由5-ATCAG-3突变为5-C TCAG-3 四、讨 论v黏附能力及其基因多态性v合成胞外多糖及其基因多态性黏附能力及其基因多态性1.高黏附力的菌株大部分来自高龋组，推测维吾尔族高龋儿童变链菌非蔗糖依赖性黏附能力强于无龋儿童。表面蛋白表面蛋白功能区A A区区C C末端末端V V区区P P区区2. spaP-a基因在高黏附力组主要为A基因型，低黏附力组以B基因型为主。说明其具有基因多态性，提示由于GGCC位点的突变引起黏附能力降低，同时会造成菌株致病性减弱，表现为个体龋低敏感性。3. AluI可以识别序列5-AG CT-3片段，spaP-c,spaP-
8、pv酶切后未表现出基因多态性。推测由于本研究人群为少数民族儿童， AluI的酶切位点可能位于两基因的保守序列之内。黏附能力及其基因多态性1.生物膜状态下，高龋组产生水不溶性葡聚糖量高于无龋组，推测变链菌水不溶性葡聚糖合成能力可以反映菌株致龋性的差异。2.Gtfs酶活性的先决条件是结合葡聚糖能力。蔗糖通过Gtfs酶的活性合成水不溶性胞外多糖是最重要的毒力因子。3.限制性内切酶BsrI和SspI对gtfB，gtfC基因进行酶切消化。 gtfB B基因型的出现对水不溶性葡聚糖的合成可能会起到减低作用，在一定程度上影响菌株的致龋能力。合成胞外多糖及其基因多态性4. Renata等同样利用这两种酶分别对
9、gtfB，gtfC基因片段进行酶切分析，发现它们经酶切后分别出现10种和5种基因型。与本研究结果相差较大，分析原因可能与研究人群的差异有密切关系。本研究对象在这两个酶切片段内可能存在更多的保守区域。合成胞外多糖及其基因多态性5.Dde对SrV+基因进行酶切分析，合成量高组出现四种基因型，表现为3-6条片段。可能是由于5-C TCAG-3 发生变异，造成其合成水不溶性葡聚糖能力下降，进一步影响菌株的致龋能力。6.国内有学者进行相同研究发现，也出现四种基因型，共有3-4条片段。与本研究差别较大。推测可能是儿童与成人口腔中变链菌变异性有关，同时民族间的差异也是重要因素。本实验中SrV+基因片段在Dd
10、e酶切序列中可能存在有较之更多的突变位点。合成胞外多糖及其基因多态性展 望课题着手居住于城市中的维吾尔族儿童进行了研究，实验结果可以为今后该民族儿童高发龋病群体的早期防治干预工作做好铺垫，提供龋病个性化治疗的基础。为了得到更加全面的维吾尔族儿童龋病致病机制，需要更进一步对全疆该民族儿童进行调查研究，尤其是对于封闭型维吾尔族儿童龋病发病病因的研究会更具实际意义。为进一步探索其龋病致龋毒力因子水平及预防龋病的发生提供实验基础。123乌鲁木齐市维吾尔族高龋儿童变链菌黏附能力明显强于无龋儿童。 不同黏附能力组中表面蛋白spaP-a基因经酶切消化后出现两种基因型，且构成比不同。提示该基因的变异可能引起表
11、面蛋白表达出现 差异导致黏附能力有别高龋组变链菌生物膜状态下合成胞外多糖能力强于无龋组。水不溶性 葡聚糖合成量高于水溶性葡聚糖。gtfB,SrV+基因在合成水不溶性葡聚 糖较高和较低组的构成比不同。提示这两个基因多态性可能与维吾尔 族儿童变链菌合成水不溶性葡聚糖能力差异有相关性以上结果提示spaP-a， gtfB， SrV+基因表现出的多态性可能与维吾尔族儿童的龋敏感性有密切关系五、小 结攻读硕士学位期间发表的学术论文致 谢v 衷心感谢我的导师赵今教授三年来对我的精心培养和悉心教导，我的点滴进步，无一不凝结着导师辛勤的汗水！v 赵老师学识渊博、临床技能精湛、科研思维敏捷，给予我无尽地启迪，是我终身学习的楷模。她热情开朗、平易近人的人格魅力与严谨求实、一丝不苟的治学态度都将使我终身受益！v 感谢一附院临床检验中心张朝霞主任、季萍老师等各位老师在实验过程中的帮助与包容！v 感谢一附院科研中心的刘涛老师、郑树涛老师在实验技术环节给予的宝贵意见和建议！v 感谢新疆医科大学口腔系及一附院研究生科、科研科、统计教研室的各位领导和老师们对我长期以来的帮助与教诲！v 感谢牙体牙髓科及其他口腔科室老师们在临床技能方面的耐心指导和帮助！v 最后，感谢我的家人，朋友和同学们一直以来默默无闻的奉献，给予我莫大的支持与鼓励！我衷心的祝福你们永远健康、快乐！512012-2-275151
