蛋白质和多肽的氨基酸序列分析

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1、第十章第十章 蛋白质和多肽的氨蛋白质和多肽的氨 基酸序列分析基酸序列分析引言引言 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在75 200Da之间，其化学通式为： 在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微 生物来源的多肽中出现D型氨基酸。 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过 肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键 、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的 构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白 质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。 因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构 功能研究中不可缺少的部分。引言引言蛋白质测序的研究历史蛋白质测序的研究历史194719

2、47采用部分水解的方法试图测定 蛋白质的氨基酸序列Consden等利用色谱技术成功测 定了短杆菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次测定了牛胰岛素的一级 结构（由51个氨基酸残基组成） Spackman、Stein、Moore制造了自 动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定 量分析进入了一个崭新的阶段Edman 推出第一台自动测序仪195819581955195519401940年前年前19671967引言引言牛胰岛素的一级结构引言引言一级结构测定的基本流程 1. 拆分蛋白质分子的多肽链; 2. 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基; 3. 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成 较小的片段; 4. 对

3、各肽段的氨基酸序列进行测序; 5. 重建完整多肽链的一级结构; 6. 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； 7. 酰胺基位置的确定。引言引言测定蛋白质的一级结构前的准备工作 1. 样品纯度必须97%以上；聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 2. 测定蛋白质的相对分子质量；SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目；种类： SDS-PAGE数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算 每种氨基酸的个数；引言引言第一节 氨基酸组成分析章节章节第二节 蛋白质的末端测定第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离第四节 肽段的氨基酸顺

4、序测定第五节 蛋白质一级结构的重建第一节第一节 氨基酸组成分析氨基酸组成分析二、特殊氨基酸的保护三、衍生方法及原理第一节第一节 氨基酸组成分析氨基酸组成分析四、氨基酸定性和定量分析一、蛋白质或多肽的水解方法五、测定氨基酸组成的实验步骤氨基酸组成分析的目的氨基酸组成分析的目的现代分离提纯技术的发展使蛋白质操 作微量化，但也给定量带来了困难，一般 很难通过常规的称量或测蛋白溶液在 280nm的光吸收值来准确定量蛋白质，所 以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质 样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据 结果便可以推算出蛋白量的可靠值。另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结 果的情况，一种可能是蛋白质的N端

5、封闭，另 一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分 是非蛋白质物质，解决这个问题的很好途径便 是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基 酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液 中的游离氨基酸。1水解 在一定温度、酸 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂，水解成 游离氨基酸。3色谱 利用高效液相色 谱对这些氨基酸 进行定性和定量 色谱分析。2衍生 在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包 括3个步骤，即： 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数 或摩尔比。氨基酸组成氨基酸组成分析的步骤一、蛋白质或多肽的水解方法

6、水解是蛋白质氨基酸组成 分析的第一步，作用是破 坏蛋白质的肽键，得到游 离的氨基酸，用于之后的 定性定量分析。 这是极其重要的一步，因 为水解质量的好坏将直接 影响到最终分析结果的正 确与否。虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。 1、酸性水解 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 通用的水解剂。 条件：6 mol/L HCI、真空、110，

7、水解时间为20 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式 。 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测 定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。 相关措施： 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时 ，算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、Val- Val、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延 长水解时间如水解92h甚至120h来

8、解决。但是长 时间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更 大。 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。 2、碱性水解 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解 剂。例如将水解样品加入5mol/L NaOH中 ，充氮气后填充管，110 水解22h。 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精 氨酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基 酸外消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此 法仅限于测定色氨酸的含量。 3、酶水解 用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解 敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。 优点是水解过程中氨基酸

9、不发生消旋化，几乎可 以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解 条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作 用。 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小 的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋 白质，对样品的测定结果可能会有干扰。 常见蛋白水解酶及其作用位点 4、微波辐射能水解 微波是一种高频电磁波，其能量传递 是通过分子的极化，而水分子的极化作用 是非常高的，微波能量的快速吸收能导致 完全水解的时间大大缩短。在微波辅助酸 水解和微波辅助酶水解中，水解时间可从 过去的几十小时缩短到几十分钟。 因此，微波辅助蛋白质水解技术的出 现大大提高了氨基酸组成分析的效率。 5、膜上蛋白质印迹样品

10、的水解（原位分析 ）如果蛋白质样品采用电泳法(如SDS-PAGE)分离 ，很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转 移到PVDF (聚偏氟乙烯)膜上，然后在PVDF膜上直 接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位(in situ) 分析。可将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部 加入200ul含7巯基乙酸的6mol/L盐酸，110 真空 水解24 h，水解结束后用200 ul 含30甲醇的0.1 mol/L盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来 ，以便进行下一步的分析。总之，蛋白质水解阶段所采用的方法 不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响 。对于不同的蛋白质、不同的研究目的、 以及样品

11、量的多少，应采取不同的水解方 法。二、特殊氨基酸的保护不同水解条件下，各种氨基酸的回 收有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸 和半胱氨酸可能遭水解破坏，导致无法 正确测定其含量。因此水解过程中，需要考虑对特殊 氨基酸的保护。 色氨酸的保护 水解酸中加添加剂：例如加入巯基乙酸和-巯基 乙醇，可使色氨酸的回收可达80。 有机酸：3molL疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在 水解时对色氨酸有一定的保护作用。 酶：利用蛋白酶作为水解剂，条件温和，对天冬 酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用。 碱：用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护 色氨酸不被破坏。 光谱法： 分光光度法：应用较早，在蛋白质分子中，如不 含

12、胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根 据其在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收， 测定色氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用 于色氨酸对酪氨酸的比值为0.21时的情况。 二阶微分光谱法：常被用来确定蛋白质中芳香族 氨基酸的含量，计算公式复杂，Hewlett Packard 公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件， 能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。 半胱氨酸的保护： 还原烷化法：产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。 烷化试剂包括4-乙烯吡啶和碘代乙酸。 缺点：为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常在变 性剂存在下进行，多余试剂和变性剂要用HPLC、沉 淀法或透析去除，每一步都可能造

13、成样品的损失。 氧化反应：过甲酸氧化反应被用来转化半胱氨酸 和胱氨酸成为半胱磺酸再进行测定。 缺点：会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成甲 硫氨酸砜，酪氨酸会降解。必须准备能分析两次的样 品量一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨 基酸的组成数据。三、衍生方法及原理 衍生是将氨基酸衍生为有利于测定或分离 的化合物。 大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无 法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍 生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。 从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后 反应法和柱前衍生法两大类。 柱后反应法 将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再 与显色剂(茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)作用

14、。 优点：比较稳定，对样品预处理要求低，容易 定量和自动化操作。 缺点：检测灵敏度不高，分析时间长(蛋白质水 解液需1 h而某些生理样品则需4 h以上)。 柱前衍生法 将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍 生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接 检测衍生物的光吸收或荧光发射。 优点：此法可检测OPA-（邻苯二甲醛），PTC- ，PTH-，DABS-，Dansyl-和DABTH-氨基酸， 分析灵敏度高，可利用HPLC进行氨基酸分析。 缺点：有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨 基酸检测。 柱后反应法 VS 柱前衍生法 几种常见的氨基酸分析方法： 1、茚三酮反应 2、荧光胺法 3、邻苯二

15、甲醛(OPA)法 4、PTC-AA分析法 5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法 6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl） 法 1、茚三酮反应 -氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，除脯氨 酸和羟脯氨酸产生黄色物质，其它氨基酸都产生蓝 紫色物质。 此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅， 在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的 含量。 2、柱后荧光胺法荧光胺能在室温下迅速和一级胺发生反应， 其荧光产物的激发波长390 nm，发射波长475 nm 。荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应 的灵敏度大约提高了3个数量级。 3、邻苯二甲醛(OPA)法 OPA最早是被作为柱后衍

16、生试剂而引进的，后来也逐 渐应用于柱前反应中。 OPA能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很 强荧光的异吲哚衍生物，该反应在室温下1 min即可 完成。 4、PTC-AA分析法 属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质一级结构 。 异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应，生 成苯氨基硫甲酰（PTC）-AA，能在254nm检出。此法 分析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法相同。 5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法 荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能与所有 氨基酸柱前反应形成高稳定性的带有荧光的DNS -氨基酸。但反应耗时。6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法灵敏度是Dansyl-Cl法的1/5，反应产生 有色衍生物，能方便地在254 nm和425 nm 处用紫外检测。有报道用DABITC代