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1、微生物作为遗传研究材料的优越性 作为遗传研究材料具有独特优势,了解微生物遗传研究有 助于理解多年来分子生物学、分子遗传学理论发展。 世代周期短,繁殖世代所需时间短; 易于操作管理和进行化学分析(纯培养与代谢产物 累积); 便于研究基因的突变(表现与选择); 便于研究基因的作用(突变型生长条件与基因作用 ); 便于研究基因的重组(重组群体大、选择方法简便 有效); 遗传物质比较简单,可作为研究高等生物的简单 模型; 在研究基因结构、功能与表达调控时更为简便。 同时:微生物的应用领域日益扩大、成就突出(微 生物工程);在遗传工程(包括动植物)中,作为重要研 究材料、工具,也具有决定性作用。第六节
2、细菌的遗传分析二、细菌遗传的实验研究方法(一) 细胞计数(培养物细胞浓度) (二) 建立纯系的方法 (三) 选择培养法鉴定突变型与重组型 (四) 突变型与重组型的批量筛选方法(一) 细胞计数(培养物细胞浓度) 培养物中微生物计数 方法是微生物学的基 本实验技术,其基本 思路是: 对原培养物进行 连续稀释; 进行平板涂布( 或混合倒平板)培养; 由于每个细胞形 成一个菌落,计数菌落 数; 根据稀释倍数计 算原培养物中的细胞浓 度。(二) 建立纯系的方法纯培养(三) 选择培养法鉴定突变型与重组型 许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养 条件有关。 营养缺陷型的筛选、鉴定: 选择培养法是根据菌株在基
3、本培养基和营养 培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原 生营养型)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正 常生长,只能在相应的营养培养基上生长)。 其它突变类型的筛选、鉴定: 对于其它的突变类型(如温度敏感型),也可 以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。(四) 突变型与重组型的批量筛选方法 选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型 ,但要检测分离含有多种突变型的混和菌 株,仅采用选择培养法要进行多次试验才 能够达到目的、效率太低。 为高效检测、分离混和群体中不同突变型 ,黎德伯格夫妇设计了影印培养法。 该方法原理与选择培养法一致,但是采用 影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不 同选择培养基
4、上同时对所有菌落进行选择培养 ,鉴定效率大大提高。细菌的基因组 nucleoid(+plasmid)1 结构: P107环状双链DNA,单倍性,以折叠或螺旋 状态存在;2 大小:长约25035000m(未螺旋) ;3 复制方式:着膜式复制。分裂特点:均等分裂,无基因重组 。Plasmid p108-109图7-3 大肠杆菌染色体的基本结构图解细菌的突变型(一)合成代谢功能的突变型 anabolic functional mutants:营养缺陷型,auxotroph, X- (二)分解代谢功能的突变型: catabolic functional mutants:lac-等 (三)抗性突变型 r
5、esistant mutants1 抗药性突变型:青霉素: penr, pens 链霉素: strr, strs penicillin Streptomycin 抗性: resistance 敏感: sensitive, susceptive 2 抗噬菌体突变型T1噬菌体 Tonr Tons T2噬菌体 Ttor TtosT6噬菌体 Tsxr Tsxs突变型的筛选 例如: 营养缺陷型的筛选: u.v 野生型细菌 完全培养基:影印培养 基本培养基: 补充培养基 :氨基酸类 维生素类 系列氨基酸 补充培养基:赖氨酸 脯氨酸 精氨酸.CMMMSM影印实验(replica plating ) Josh
6、ua Lederberg sex factor, 性因子) 。 F因子的化学本质是 DNA,可以自主状 态存在于细胞质中 或整合到细菌的染 色体上。 F因子可以在细菌细 胞间进行转移并传 递遗传物质。图 F因子的结构图 F因子的整合F因子状态与遗传物质转移特点F factorF因子状态与遗传物质转移特点不能进行 极少转移 因子,大量 转移细菌基 因。转移因 子,还转 移细菌个 别基因。因子状态 游离 整合菌株类型 + F fr - 菌株性别 杂交类型 + - F - fr - - - 传递特点 只转移因子不转移细菌基因。F+ F-(1)F纤毛(F pili) 由纤毛 素(pilin)蛋白构成,
7、接 合管仅使细胞初步接 触; (2)转移启动 转移起始 区(transfer origin, Ori T) ,滚环复制; (3)单链转移,复制,或 重组。Hfr F-(1)F整合后呈线状 ; (2)转移起点0riT位 于中间; (3)先转移F因子的 一部分,F的后面 部分最后转移。 (4)重组子仍为F-高频重组菌株P125异源双 链三 细菌基因重组的特点 部分二倍体:指含有一 个完整基因组和部分基 因组的细胞.(半合子 )P85内基因子:P85外基因子:P85 细菌基因重组的特点:(1)细菌基因重组是在部 分二倍体中进行; (2)只有偶数交换才产生 有活性的重组体;(3)相反的重组体不出现 .
8、5-36中断杂交与重组作图一、中断杂交实验原理 1中断杂交实验 Hfr thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strsF- thr- leu- azis tons lac- gal- strr选择培养基 9 11 18 25 加str 无thr, leu 影印接种 azi Ton lac gal 接合中断接合杀死Hfr检查基因作图2 中断杂交实验作图原理 A: Hfr染色体上的基因是从某一点开始,以线性方式进入-的, B:离原点愈近的基因进入-愈早,出现在-中的比例愈大 ,反之,则愈小.3 中断杂交作图: 指在HfrF-杂交中,把接合中的细菌在不 同时间取样,搅拌中断杂交
9、, 分析受体菌基因型,以Hfr基因 出现在-中的先后为顺序,以转移的时间(分钟)为图距单位 进行基因作图的方法.4 作图(原点) azi Ton lac gal F0 9 11 18 25min大肠杆菌基因组很大(全部转移需要100分钟),其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成。1)不同的Hfr品系转移的起始基因是不同的;说明:因子可以在不同的位点插入细菌染色体; 2)与同一基因相邻的基因是相同的;说明:不同品系细菌的基因顺序是相同的; 3)Hfr基因可以两个不同方向转移基因进入-; 4)一个Hfr转移的起始基因是另一个Hfr最后转移的基 因说明:细菌的染色体是环状的. P8
10、5 图 5-35 thr lac his galpurthipro2glyHfrH331215 E.coli的染色体呈环状三、重组作图 (难点) 细菌的重组作图的前提 (1) 两个基因紧密连锁; (2) 两个基因进入受体菌的先后; 例:已知lac 和ade紧密连锁; lac+比ade+先进入-; 杂交、选择、统计重组体Hfr lac+ ade+ strs F- lac- ade- strr 选择培养基 加str,无ade -ade+strr 伊红美兰培养基 紫红色菌落ade+ lac+ 粉红色菌落ade+ lac-B: lac+ ade+ A:lac+ ade+ C: lac+ ade+ F-
11、 lac+ ade+ 亲组合 52 F- lac- ade+ 重组合 153 计算重组体重组值=重组菌落数/总菌落数100% =(lac- ade+)/(lac+ ade+ )+(lac- ade+) 100% = 15/(52+15) 100% 20% 已知中断杂交实验该两个基因相距1分钟,重组作图与中断杂交作图的图距关系:1分钟图距 20% 重组值 4 E.coli染色体全长:100分钟;含有:4.6 106bp20 100 2000 cM1cM 2000bpF因子与性导一 F因子与F菌株F因子:指整合态的F因子从Hfr上错误切割下来,且带有细菌个别基因的F因子。F菌株:指带有F因子的细菌
12、。二 性导: 指利用因子将供体菌的基因导入受体形成 部分二倍体的过程。F F- F + F 图7-12 F因子的起源和部分二倍体的形成 (仿自Griffiths,2005) F和F因子不同: F品系转变成Hfr品系的频率要高于F品系 F变成Hfr时F因子整合到同一(所带基因 的同源)位点上,而F变成Hfr时可整合到不 同位点; FF 时可高频传递特定的基因,形成部分 二倍体。而FF要么产生F但不转移任何 基因,要么以107将宿主的基因按顺序转入受 体,但受体仍为F。所转移的基因是不同的 。 性导: 指利用因子将供体菌的基因导入受体形成 部分二倍体的过程。F F- F + F 1 性导的特点:只
13、能转移因子插入位点附近的基 因。2 性导在遗传分析中的应用:(1) F因子可自主复制; (2) 性导所形成的部分二倍体可用作测定两突变形间的互补 试验; (3) 确定部分二倍体中两基因的显隐系; (4) 利用两基因的共性导率作图.P88:四种菌株总结 杂交关系Donor recipientdefective phage Generalized transduction Restricted transduction转导(transduction)与作图Lerderberg and Zinder LT22(P22溶原) phe - trp - tyr - his + LT2 (P22敏感) ph
14、e +trp + tyr +his 结果:在MM上以10-5频率出现原养 型菌株。 两亲本菌株分别置于U型管的两臂 时,在LT22的一边出现了原养型菌 株(与接合不同)。 进一步实验证明在两个菌株间传递 遗传物质的是沙门菌的一种温和噬 菌体P22。LT2LT22prototroph普遍性转导噬菌体的形成 噬菌体的头部误包装了细菌的染色体片段( 大小相似的),形成转导噬菌体,即: 噬菌体头部+供体菌的染色体片段 或称为:完全缺陷噬菌体,假噬菌体。P1包装不严格,其中约有1/100的宿主片段可能会被 错误地包装到噬菌体中,称为“偷渡” 。图7-15 普遍性转导病毒颗粒的形成与受体细菌被转导的结果G
15、enerlized transductionAbortive transduction普遍性转导作图(1) 作图原理:两基因的共转率愈大相距愈近,反之则愈 远(2)双因子转导作图 例如:确定abc三个基因在染色体上的顺序分别测定a-b、 a-c、 b-c 的共转导率;如果:a-b的共导率最大,a-c较大,而b-c的最小 ,则顺序为:b a c 两点法基因顺序的确定 杂交测定三个共转率: 例:P1供体 thr+ leu+ azir 受体thr- leu- azis转导子基因型 共转率 leu+ azir 50 % leu+ thr+ 2 %thr+ leu+ 3 %thr+ azir 0 % 基因可能顺序thr azi leu 或 thr leu azi基因顺序是: thr leu azi 2)三因子转导作图选择thr+转导子选择leu+转导子(2)中间位点法 供体菌:supC+