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1、 第第 十十 章章 微生物与基因工程微生物与基因工程基因工程概述;基因的分离、合成和定位诱变；重组DNA分子的构建；重组子的扩增及筛选外源基因在细菌中的表达；基因工程的应用1. 基因工程概述基因工程（genetic engineering)：把分离到的或合成的基因经过改造, 插入载体中;重组子导入宿主细胞内，使其扩增和表达;最终得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。1.2 基因工程大事记1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆;1978 Genentech公司-人胰岛素-世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素
2、在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息1.3、基因工程基本过程1、目的基因的提取分离或合成外源基因。2、体外重组 ：外源基因与载体体外连接，构建重组DNA分子3、重组DNA分子导入细胞；4、目的克隆的筛选与鉴定；5、控制外源基因的表达；控制适当条件，外源DNA表达，获得表达产物或转基因动物、转基因植物。微生物与基因工程的关
3、系基因资源：基因工程载体基因工程工具酶；基因工程宿主基因工程的生物反应器；基因工程理论研究2 目的基因的获得从基因文库或cDNA文库中分离目的基因基因的化学合成PCR扩增基因基因的定位诱变2.1 从基因文库或cDNA文库中分离目的 基因一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。基因文库指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。cDNA文库细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（大约15%），因而，mRNA逆转录为cDNA所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。cDNA文库 指生物体全部mRNA的
4、cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写, 或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。 cDNA从基因文库或cDNA文库中分离目的基因根据目的基因序列，可利用标记的基因探针、限制性内切酶、聚合酶链式反应（PCR）等方法从文库中筛选出目的基因。如果筛选的是表达文库，可以通过检测基因产物来筛选。2.2 基因的化学合成l目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为 150200 个核苷酸左右。方法基因的化学合成是先合成许多寡核苷酸，彼此交错互补，然后再将它们连接起来。 2.3
5、 PCR 扩增基因 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR一种体外扩增特定DNA片段的技术，在该反应中，使用与目的DNA两端序列互补的寡核苷酸作为引物，进行多轮的DNA合成，每轮反应包括DNA变性，引物退火和在DNA聚合酶催化下的DNA合成。1984年，美国Cetus公司遗传部Mullis发明； 1993年, 获得诺贝尔化学奖。 DNA 片段两端的序列已知，先合成一对寡聚核苷酸引物，它们各自与所需扩增的 DNA 片段的末端互补。PCR 由 3 个基本反应组成：PCR 扩增技术原理 DNA 片段以 2 的指数增长，重复 2530 次循环，扩增的DNA 片段
6、拷贝数可增至 106 -107 倍。 变性:在高温下,模板 DNA 变性,双链被解开成为两条单链; 退火:反应系统降温，引物与模板 DNA 两端的碱基配对；DNA聚合酶使引物3端向前延伸，合成与模板互补的 DNA新链。 延伸:条件：结果 ：2.4 基因的定位诱变可在基因精确限定的位点引入突变，包括删除、插入和置换特定的碱基序列，从而得到含突变碱基的突变基因。 体外定位诱变3 重组DNA分子的构建 克隆载体 基因工程工具酶 外源基因与载体的体外连接3.1克隆载体指负责将外源基因运送到宿主细胞中并进行复制与扩增的运载工具。常用载体类型 ：克隆载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启 动子
7、、RBS、终止子等), 使目的基因能够表达的载体。 指能在两种不同的生物中复制的载体. 表达载体穿梭载体目前克隆载体种类细菌质粒载体噬菌体载体与黏粒载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体与噬菌质粒载体真核生物克隆载体及人工染色体。pBR322质粒载体的结构特征环状双链DNA分子，由4361bp组成;colE复制起点，外源DNA大小为5kb左右;四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因（Ampr）;24单一酶切位点（ Tetr中7个， Ampr中3个）。常用工具酶种类 限制性内切酶 把DNA长链切割为短的片段 DNA连接酶 将两段DNA片段拼接起来3.2 基因工程工具酶3.2.1 限制性内切酶
8、是指能识别双链DNA分子中的特定序列，并在识别位点中或其附近切割DNA的一类内切酶。限制性内切酶:II型限制性内切酶的切割方式形成粘性末端（cohesive end）;形成平末端（blunt end）; 识别序列通常由46个碱基对组成,呈回文结构;限制酶作用所产生的DNA片段的形式：3.2.2 DNA连接酶催化在两条DNA链的末端形成磷酸二酯键，包括粘性末端碱基配对的两条DNA链和末端都是平末端的两条DNA链连接酶的作用可以在体外将目的基因与载体共价连接构成重组DNA分子；连接酶的功能大多数DNA连接酶是从T4噬菌体中分离出来的3.3 外源基因与载体的体外连接重组DNA分子的构建：在分别获得外
9、源基因和合适的载体后，在体外将基因与载体进行连接，构建成为一个能在宿主细胞中自主复制的DNA分子。黏性末端连接法4 重组子的扩增与筛选体外包装（将重组DNA分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，组装成具感染力的噬菌体粒子）感染宿主。较转染效率要高出104105倍。4.1 外源DNA导入原核细胞转化:外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞(感受态)；转染：外源 DNA构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒， 则可通过转染方式进入宿主细胞(感受态) 。DNA的侵染4.2 重组体的筛选与鉴定l载体选择标记的鉴定l目的基因序列的鉴定l外源基因表达产物筛选4.2.1 载体选择标
10、记的鉴定 (1) 抗生素抗性选择法(2) 插入失活法(3) -半乳糖苷酶显色反应法初步的、大量的筛选鉴定方法(2) 插入失活法 因外源 DNA 的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（ insertional inactivation ）基因 产物无基因 产物抗性基因1. 载体2. 重组DNA分子抗性基因失活a) pBR322载体四环素 抗性基 因氨苄抗 性基因b) 重组DNA分子 目的基因抗性插入失活固体平板含T培 养基含A培 养基插入失活法筛选目的克隆含T培 养基4.2.2 目的基因序列的鉴定l菌落（或噬菌斑）原位杂交l内切酶图谱鉴定 lDNA序列测定 初步筛选结果的基础上，进一步鉴定的
11、方法DNA 序列测定 最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的 DNA 进行序列测定 ;4.2.3 基因表达产物的鉴定 l免疫活性测定 l生物活性测定l氨基酸序列测定 表达产物免疫活性测定l如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分具有抗原性，则可与其特异抗体发生免疫反应。进而用western blot进行鉴定。确认目的蛋白成功表达；生物活性测定表达产物是酶可以测定其酶活性的大小;表达产物是酶的抑制剂，可测定其抑制酶活性能力的大小；既可用于初步筛选，又可用于最终鉴定；表达产物氨基酸序列测定测定表达产物的肽谱；或分析表达产物N-末端和C-末端氨基酸序列，对表达产物的鉴定具有重要意义。可用于
12、表达、纯化产物的最终鉴定；前提条件必须得到纯度高的蛋白；5 外源基因在细菌中的表达 所谓表达载体（ expression vector ）是指包含宿主细胞基因表达所需调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体； 克隆基因可用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞、以至整体动物进行表达。 宿主细胞的类型5.1 外源基因的转录启动子转录的调节和控制转录终止子5.1.1 启动子 （ promoter ） 是指 RNA 聚合酶结合于 DNA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。为使目的基因高效表达，必须选择强启动子。强启动子包括lac 启动子、trp 启动子、ta
13、c 启动子、P(L,R) 启动子、T 7 噬菌体启动子。启动子5.1.2 转录的调节和控制第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长, 获得足够量的细胞。第二阶段, 启动调节开关，使外源基因高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。 某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；转录的调控的必要性转录调控的理想状态基因工程中常用的转录调控方式诱导物诱导：如IPTG乳糖操纵子的启动子；温度诱导：P(L,R) 启动子RNA聚合酶调节： T 7 噬菌体启动子。温度诱导当用PL、PR启动子构建表达载体时，其温度敏感突变株cI 857 ts在30培养时，cI基因产生有活性阻
14、遏蛋白，阻遏PL、R转录，细菌大量生长；当温度上升至42时，阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录。当温度敏感突变株表达外源基因时，在30 细胞大量生长。当温度升到42 时，打开转录开关，启动外源基因转录。调控方式实例5.1.3 转录终止子转录终止子指一段位于基因或操纵子的 末端，具有终止转录功能的特定 DNA 序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的 mRNA 过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使 mRNA 形成妨碍翻译的二级结构。 5.2 外源基因的翻译核糖体结合位点：SD序列；密码子的偏爱性：偏爱密码子、稀有密码子；终止密码子： UAA，UAG，UGA ，以UAA
15、终止能力最强。5.3 外源基因的表达产物非融合蛋白表达：表达产物直接为外源蛋白；融合蛋白表达：外源蛋白与宿主蛋白形成的杂合蛋白；分泌表达：表达蛋白被分泌到周质或胞外；包涵体：5.3.2 融合蛋白表达 是指外源蛋白与宿主蛋白形成的杂合蛋白融合蛋白融合蛋白表达载体将原核细胞操纵子的起始部分与外源基因的编码部分连接，并使其阅读框架保持一致，确保所转译的外源蛋白的正确性。表达载体PSD裂解启动子P外源基因宿主 基因表达融合蛋白的优点 纯化不易易于高效表达融合蛋白的 N 端总是选择天然的高表达的宿主蛋白质，其 mRNA 具有较强的翻译能力；在细胞内稳定性好外源蛋白特别是相对分子量较小的蛋白，通常在宿主细
16、胞内极易被胞内蛋白酶所清除。但是如果构成融合蛋白，就可使外源蛋白不受宿主细胞降解；需要切除来自宿主的多肽链，才能得到目的蛋白。5.3.3 外源基因的分泌表达分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。通常信号肽与外源蛋白的N端连接，由于信号肽中含有带正电荷的氨基酸和疏水氨基酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。如果合成的外源蛋白能不断从细胞分泌出来，不仅可免受宿主细胞中蛋白酶的降解，而且有利于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。 分泌表达的优点分泌型表达载体SD信号肽启动子P外源基因终止 序列5.3.4 包涵体 （ inclusion body ） 形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对其的降解，也可避免外
