荧光及其荧光单分子跟踪技术

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1、中国石油大学信息与控制工程学院荧光及其荧光单分子跟踪技术2011.11鄢志丹中国石油大学信息与控制工程学院1.荧光什么是荧光；分子荧光的主要特性有那些； 2.荧光显微技术荧光显微镜；探测传 感器；荧光显微技术的应用领域； 3.荧光单分子检测 技术单分子检测 意义；荧光单分子检测 特点、应用范围和关键技术； 4.一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法图像去噪；位置估计；伪点剔除；精细定位；轨迹生成；特性评价；真空设备 ； 5.总结 及思考题主要内容:中国石油大学信息与控制工程学院思考题思考题1、什么是荧荧光？它有哪些主要特点？2、荧荧光如何从激发发光中分离出来，它有那么主要的探测测器件？3、单单分子

2、检测检测 的应应用领领域有哪些？4、单单分子跟踪算法分为为几个重要步骤骤？5、IDGM（图图像去噪高斯掩膜）与2DDGF（二维维直接高斯拟拟合 ）算法相比，有什么优势优势 ？6、荧荧光显显微技术术如何实现实现 与真空分子生长长（蒸发发）技术术的耦合 ？中国石油大学信息与控制工程学院1.荧光中国石油大学信息与控制工程学院荧光（ 1852年，英国科学家Stokes) ：1/5：荧光（Fluorescence） 光致发光：某些分子受外界可见光或紫外线激发而出射光子的现象； 荧光和磷光：激发态电子排布和光子发射路径不同； 荧光发射过程：吸收、内转移、振动驰豫、荧光发射 磷光发射：系间窜越分子荧光发射能

3、量图光致发光中国石油大学信息与控制工程学院分子荧光特性：1/5：荧光（Fluorescence） 量子跳跃特性：发射暗态交替的量子跳跃过程；在实验中可观察到单分子荧光强度和荧光光谱的涨落； 荧光偏振特性： 单个荧光分子因其具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩， 因而只吸收那些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的 光子，并发出具有一定偏振方向的荧光；Stokes平移能量间隙 Stokes平移： 发射光谱和激发光谱； 荧光发射光谱较之 激发光谱会产生红移；中国石油大学信息与控制工程学院分子荧光特性：1/5：荧光（Fluorescence） 荧光饱和和荧光淬灭： 荧光饱和：当激发光强增加到一定程 度后

4、，若持续增加激发光强，发射的 荧光强度不但不增加，反而会减小。 荧光淬灭：荧光分子在与某些物质作 用下，出现发射荧光减弱甚至消退的 现象。 真空中的p-6P分子连续荧光光谱 p-6P分子荧光光谱淬灭 荧光低温特性： 在低温环境下，由于分子的转动能、振动能 及其多普勒效应大大减少，其荧光量子产量 和荧光强度增大，荧光寿命增加，荧光发射 光谱半峰全宽（FWHM）变窄。不同温度下的p-6P分子荧光光谱中国石油大学信息与控制工程学院2. 荧光显微技术中国石油大学信息与控制工程学院荧光显微镜家族： 种类繁多，包括落射式荧光显微镜、全内反射式荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜、驻波 荧光显微镜、受激发射损耗荧

5、光显微镜等； 激发样品方式不同，但荧光分离原理近似； 基本原理：利用荧光滤镜组出射一定波 长的激发光激发样品以产生荧光（比激 发光波长长），该荧光被物镜采集后， 再次经由荧光滤镜组消除不是荧光波长 的其他光，最终使荧光到达光学传感器 。落射式荧光显微镜2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy ） 特点：高灵敏度、高分子选择性、高信 噪比；中国石油大学信息与控制工程学院荧光滤镜组 ： 把微弱的荧光从激发光中分离出来。2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy ）结构图光谱图 激发滤镜的带通波长范围必须是分色滤镜和发射滤镜的阻碍波长范围，而发射

6、滤 镜的通过波长范围在分色滤镜的通过波长范围之内； 荧光滤镜组的选择要针对所观测分子，须明确其激发光谱和荧光发射光谱特征。中国石油大学信息与控制工程学院探测传 感器：2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy ） 光谱探测：光谱仪（Spectrometer）工作原理 光谱仪通常由棱镜或衍射光栅等构成，可将成分复杂的入射光分解为不同频率-光 强的光谱线； 单色、多色之分。实物图 光强探测：光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT)实物图 PMT由光电发射阴极、聚焦电极、电子倍增极及电子收集极（阳极）等组成，它是 具有极高灵敏度和超快时间响应的光探测

7、器件。 图像探测：电荷耦合元件（Charge Coupled Device,CCD）工作原理 CCD能将光学信息转化为数字信号，具有低噪声、高灵敏度等特性； 黑白、彩色；数字、模拟之分。实物图中国石油大学信息与控制工程学院荧光显微技术应 用领域：2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy ）荧光 显微 技术生物细细胞观察细胞的形态和数量鼠脑羊肺材料物理观测分子分子生长过程并六联苯纳米纤维生长生物化学观察化学反应过程发出绿色荧光的老鼠药药学医学确定样品成分石油地质质等烃类成分和含量、 及在岩石中的存在方式等油质沥青发 黄、白、绿、蓝等色荧光， 为石油组分中的烃类化合物；

8、胶质沥青以 橙色荧光为主，为含氧、氮、硫的烃类； 沥青质发褐色荧光，为不溶于石油醚的胶质 沥青、非烃及沥青质。中国石油大学信息与控制工程学院3.荧光单分子检测 技术中国石油大学信息与控制工程学院3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）为什么要进行单分子检测 ：研 究 意 义义1. 排除平均效应，得到大量的个体信息2. 单分子的特征对局部场的存在非常敏感，可以反映局部微观环 境的信息3. 能够揭示随时间变 化的分子特性有可能观 察到未知 领域中的 新效应， 有利于发 现新的实 验现 象， 甚至因之建 立新的理 论中国石油大学信息与

9、控制工程学院3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）目前的主要方法： 近场方法：STM，AFM等； 远场 方法：荧光显微镜； 其他方法：微流体、磁镊、光镊、超快振动谱 等 。扫描隧道显微镜原子力显微镜中国石油大学信息与控制工程学院3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）荧光单分子检测 ： 快速；非接触；多分子检测 与跟踪；分子选择 性强；纳米级分辨率；光谱信息和图像信息荧光单分子检测A. 单分子 荧光寿命B. 单分子光 谱C. 单分子 荧光偏振 D.单分子 共振能

10、量转移E.单分 子 跟踪等荧光单分子检测的应用领域中国石油大学信息与控制工程学院3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）荧光单分子检测 的关键技术：确保单分子的信号大于背景干 扰信号 (有效减少拉 曼散射、 瑞利散射及其杂质荧 光所造成 的干扰)在被照射的体积中只有一个 分子与激发光发生相互作用 （调整研究体系的浓度或密 度）中国石油大学信息与控制工程学院4.一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院基于荧光显微成像的单分子跟踪 多方面的单分子跟踪实验 以及单分子跟踪算法 的研究。如：美国埃默里大学、乔治城

11、大学、华 盛顿大学、伊利诺伊卫斯理大学，英国曼彻斯 特大学和瑞士生物医学图像组等四种典型运动轨迹 （A 静态；B 简单扩 散；C 单方向扩散； D 限制区域扩散3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法 材料科学、细胞学、生物物理、生物化学等领 域 跟踪分子运动、获取运动轨 迹、分析扩散方式 、精确扩散速率，可得到丰富而详细 的动力学 和统计 学信息。 分子马达特性；蛋白分子的聚核与裂解；胶体 相互作用；细胞内或细胞间反应机理等中国石油大学信息与控制工程学院20原始图像图像去噪特征点位置估计伪点剔除高斯掩膜精细定位概率轨迹链接实 现 快 速 高 精 度快速高精度单分子跟踪算法快速高精度单分子实

12、时跟踪算法是进行实时单分 子跟踪的必然要求。 该算法包括图像去噪处理与高斯掩膜质心法相结 合的定位算法和同时考虑等效光强和帧间最大运 动位移的同分子概率链接算法。3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院理想单分子像加入背景噪声加入散粒噪声图图像去噪算法:式中：单分子仿真图像图像重构 A (转化为浮点型数组)散粒噪声u背景噪声: 光学器件残余荧光； 样品杂质荧光；非焦平面杂散荧光； 瑞利散射光；CCD读取噪声、暗电流；u散粒噪声（像素噪声，离散化噪声） ： CCD器件进行离散光电子计数产生的具有泊松分布的信号的选取很重要u用图像去噪算法去除背景噪声和散粒噪声的后，

13、单分子图像信息便凸显出 来背景噪声3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院特征点位置估计: 像素级分辨率采用图像数学形态学处理技术中的256级灰度膨胀算法来实现 区域极大值 的选择 ，在进行膨胀算法时，以w为半径创建结构圆，并将图像向上下左 右四个方向外延w个像素，选择图 像膨胀前后像素值的相同点即是极大值 点滤波后图像膨胀后图 像3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院伪点伪点剔 除u设定一个百分比r，当极值点像素值位于全部像素 值前 时r ，此极大值即为估计中心位置，否则剔除 之；等效光强: 式中：u引入等效光强的概念，进行二

14、次剔除；特征点3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院u采用结合质心法和二维直接高斯拟合两种算 法优点的高斯掩膜精细定位算法；运算速度快；精度高；适合实时的单分子跟踪研究精细定 位式中：3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院第i个特征点在两帧间移动的实际距离相邻两帧分子可能移动的最大距离 两特征点点等效光强之差最大可能移动距离下一帧检测 到的特征点轨迹链 接式中：两特征点点等效光强的平均值u链接，即在确定每帧的单分子 位置坐标后，通过合理的链接算 法把表示同一分子的点以时间 序 列的方式连接起来u以等效光强和运动位移为评 价 因

15、素的概率法，是一种有效的特 征点匹配方法3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院荧光单分子仿真图 像 物镜: 放大倍率：50 NA值： 0.55 中继放大棱镜: 放大倍率：4 UV-1A荧光滤镜组 : 典型激发波长：365nm 典型发射波长：420nm 电子增益CCD: 成像面积：8mm8mm 有效像素：1004(H)1002(V)光学分辨率: 0.465m 衍射斑第一零级: 93.16m12像 素中心固定，峰值不同同一背景噪声1000帧序列图像u实验 用荧光显微成像系统配置3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院IDGM与2DD

16、GF(直接二维拟 合）的比较分析单分子定位算法精度分析一IDGM和2DDGF算法的运算时间 比较(a) (b) (a) Biasp；(b) pIDGM和2DDGF算法的Biasp和p随SNR变化关系 对于相同处理量的荧光图像序列，IDGM算法不仅运算时间 短，约为 2DDGF的1/10 ； 其计算值的准确度和精密度更高。 对于相同处理量的荧光图像序列，IDGM算法不仅运算时间 短，约为 2DDGF的1/10 ； 其计算值的准确度和精密度更高。3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法中国石油大学信息与控制工程学院仿真过程中的一条轨迹3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法仿真与实验中国石油大学信息与控制工程学院荧光单分子跟踪研究的真空设备3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法超高真空系统整体示意图1)超高真空腔；2)真空阀门；3)传输真空腔；4