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1、微生物学实验 王振河微生物实验的意义、研究进展 和实验内容一、研究内容研究微生物的形态、结构、生理生化遗传变异、微生物与其他生物、与自然界之间的关系1. 机理研究：微生物适应环境的机制鞭毛运动的机理等是生化和分子生物学研究的重要内容2. 微生物与实际应用微生物与发酵工程 微生物与环境工程 微生物与农业 微生物与医学领域 微生物与食品工业二、微生物学研究进展微生物基因组学研究（Microbial Genomics）不可培养微生物 （Uncultured Microorganisms ） DNA芯片（DNA Chip） 三域学说（Bacteria, Archae, Eucaryote）三、微生物学
2、与Nobel奖到目前为止，几十项Nobel生理学 和医学奖，化学奖都与微生物学有关参考：沈萍教授微生物学绪论 部分Nobel获奖者全书四、如何进行微生物学实验严肃认真科学态度分析问题搞清原理五、微生物实验安排与考核基础实验：80%，12次，一次考试 自主设计实验：20%设计实验方案实验操作总结汇报微生物实验课注意事项课程简介：必修课，24学时、1个学分考试成绩按以下公式计算：平时（10）操作考试（20）笔试（70）课堂纪律u严格遵守实验室规章制度u严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退（1次）迟到（3次）工作服实验室安全和卫生u安全 实验室严禁吸烟。 注意用水、防电和防 火 正确使用化学试剂和 仪器
3、 u卫生 每次实验需留下6位同学值日，协助保 持实验室清洁实验一 细菌的单染色及 油镜的使用u实验目的u实验原理u实验材料u实验步骤u实验结果u问题与讨论一、实验目的u学习并掌握普通光学显微镜的构造和 油镜的使用技术及维护的基本知识u学习微生物涂片、单染色的基本技术u初步认识细菌的形态特征，u学习简单的无菌操作技术二、实验原理1u显微镜的构造 1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹 彩光圈、 反光镜等)。它使 检视物放大,生成物象。2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒 、物镜转换器、载物台、载物 台转移器、粗调节器、细调节 器等部件.它起着支持 调节 固 定等作用.图1-1-2 光
4、学显微镜的成像原理倒立的虚像u显微镜的放大倍数和分辨 率1.放大倍数：物镜放大倍数目镜 放大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜 辨析两点之间距离的能力。可用 公式表示为：D=/2nsin(/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的 最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射 率。 ： 镜口角（即入射角）。 D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰u油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当 光线由反光镜通过玻片与 镜头之间的空气时，由于 空气与玻片的密度不同， 使光线受到曲折，发生散 射，降低了视野的照明度 。若中间的介质是一层油 （其折射率与玻片的相近 ），
5、则几乎不发生折射， 增加了视野的进光量，从 而使物象更加清晰。u根据公式D=/2nsin(/2 ) ，增大分母，使得D值 减小，分辨率增大。1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免 损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗 布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍 镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在 使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压 碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手 托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片 滋生霉菌而腐蚀镜片。显微镜保养和使用中的注意事项油镜的使用u待后边演示二、实验原理2u细菌的单染色
6、 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。 利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体 与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其 形态和结构。染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态 。 三、实验材料u奥林巴斯双筒普通光学显微镜u沙黄染色液。u培养24h的大肠杆菌（E.coli)u载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、 二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。四、实验步骤一、制作大肠杆菌观 察片现场演示无菌操作涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检二、显微 操作现场演示1.低倍镜观察：粗调
7、、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央 滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然 后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残 留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头三、口腔微生物的观察 1.在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许 与水滴充分混匀，涂成薄膜。 2.将涂片于室温中自然干燥后，按单染色法的步骤，进行固定、 染色、水洗，干燥后镜检。五、实验
8、结果u用油镜观察大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌和口腔微生物的染色标本， 并绘图。 六、问题与讨论1.涂片为何要固定？固定加热时间过长 会怎样？ 2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察 ，而不是直接用高倍镜或油镜观察？内容回顾一、原理 显微成像原理 油镜使用原理 单染色原理二、技术和方法 无菌操作技术 制片和单染色方法 显微镜使用方法本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！请第一排同学留下值日下周再见！用于生物染色的染料主要有碱性染 料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料 的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合 。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中 性、碱性或弱酸性
9、的溶液中时常带负电荷， 所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱 性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离 子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当 细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细 菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复 红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前 两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。 实验二 细菌染色法及微生物的观察 简单染色法是只用一种染料使细菌着 色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞 的构造。 革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革 兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类， 是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所 以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌
10、的 细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细 胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且 肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱 色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性， 使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果 细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含 量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径 缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的 颜色。 细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的 亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即 设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在 菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上，固染色时一般不加 热固定，
11、以免荚膜皱缩变形。细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不 易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着 色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既 难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计 的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着 色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当 染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜 色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料 对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而 能更明显地衬托出芽胞，便于观察。细菌的鞭毛极细，直径一般为 1020nm，只有用电子显微镜才能观察到 。但是，如采用特殊的染色法，则在普通 光学显微镜下也能
12、看到它。鞭毛染色的方 法很多但其基本原理相同，即在染色前 充用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上使 鞭毛直径加粗。然后再进行染色。一、实验目的和内容 目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及 其结构的染色技术。 内容： 1、学习细菌单染色操作技术。 2、学习革兰氏染色技术。 3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色 方法。 二、实验材料和用具 1、单染色法： （1）大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌种。 （2）吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染 色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二 甲苯、无菌水 （3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精 灯、载玻片、吸水纸、无菌
13、牙签。 2、革兰氏染色： （1） 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l 2种； （2） 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏 碘液、95乙醇、石炭酸复红液等)、 （3） 香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸 、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、 酒精灯。3、荚膜染色：(l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3 5天的团褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培养23天的硅酸盐细 菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液 、石炭酸复红
14、染色液、黑色液。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。4、鞭毛染色： (1) 在牛内膏蛋白胨斜面上培养1924 小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培 养体在取用前经过每日移植代，连续移 植57代。 (2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和 B。 (3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻 片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜5、芽孢染色： (1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养2436小 时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。 (2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊 子。 (3)显微镜。 (4)香柏油、二甲苯、擦镜纸 (5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。三、操作步骤1、单染色法（1）涂片 在
15、洁净无脂的载玻片中央滴一 小滴无菌水（图410a），用无菌操作方法从 菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成 薄膜，涂布面积约11.5cm2（图410b）。（2）干燥 将涂片于室温中自然干燥。（3）固定 手执载片端，使涂菌的一面 向上，将载片通过微火23次。在火上固定时 ，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载 片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图410c)。（4）染色 将涂片置于水平位置，滴加染 色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图410d)。（5）水洗 倾去染色液，斜置载片，用自 来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在 涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液 的颜色为止(图410e)。（6）干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸 干，注意不要擦掉菌体(图410f)。 （7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍 镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜 观察。图410 单染色方法 （二） 革兰氏染色法1、制片（1 ） 涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取 菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做
