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1、实实 验验 四四圆盘电泳分离人血浆蛋白质圆盘电泳分离人血浆蛋白质紫外吸收法测定蛋白质的含量紫外吸收法测定蛋白质的含量一、一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳圆盘电泳）玻璃管玻璃管分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶(- (-) )(+)(+) 主要过程 n凝胶柱的制备n加 样n电 泳n剥 胶n固定和染色n漂洗(- (-) )(+)(+)1凝胶玻璃管的准备（封口） 2分离胶的制备 3浓缩胶的制备 4. 玻璃管安装n n凝胶柱的制备与安装凝胶柱的制备与安装封口胶封口胶 封口防漏封口防漏 配液防凝配液防凝 操作防毒操作防毒滴管灌胶6%分离胶的制备（每组四人）nA液1mlnC液2mln
2、H液2mlnG液5mln正丁醇 封顶等待聚合（约30分钟）混匀后分装混匀后分装 4 4管管3%浓缩胶的制备（每组四人）nB液1mlnD液2mlnE液1mlnF液4mln正丁醇等待封顶聚合（约10分钟）混匀后分装混匀后分装 4 4管管注意事项：n丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（C、D）是神经毒性 试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触 。大量操作时应在通风橱中进行。用完加盖。nTEMED（A、B）要密封保存，用完加盖。n过硫酸铵（G）溶液最好新鲜配制，以防止氧化失 效。用完加盖。n核黄素（E）需避光保存。玻璃管安装玻璃管安装（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）n n加加 样样n n电电
3、 泳泳(- (-) )(+)(+)电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时止）n n剥剥 胶胶n n固定和染色固定和染色n n漂洗漂洗固定（时间固定（时间5 5minmin）染色（时间染色（时间2 2minmin）漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮实验分组（每人做一管，每4人配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管分离胶配制与灌胶（浓度为6%，每组总体积为10ml，灌胶高度为78cm）封正丁醇（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min）浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为 8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样）倒掉正丁醇 灌浓缩胶封
4、正丁醇（观察界面，判断凝固时间）安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）样品处理并加样（20ul）加buffer电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时 2mA/管，距底1cm时停止）剥 胶固定（时间固定（时间5 5minmin）染色（时间染色（时间2 2minmin）漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮（一）电泳的基本原理及相关知识 电泳的概念电泳的概念带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 电泳的基本原理电泳的基本原理主要利用分子之间的两个方面的差异来分离：分子所带电荷分子所带电荷电荷
5、性质（电荷性质（+/-+/-）电荷数量电荷数量 分子形态分子形态分子量大小分子量大小分子的三维构象形状分子的三维构象形状 电泳分离蛋白质的原理电泳分离蛋白质的原理 蛋白质两性解离与等电点 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异 实验室中常用到的电泳方法实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）（以介质分类） 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大 ，温度低时，聚合速度减慢。，温度低时，聚合速度减慢。 电泳的影响因素电泳的影响因素 带电粒子的性质 电场强
6、度 溶液的pH 溶液的离子强度 电渗现象 环境因素 （二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 两单体构成的人工合成凝胶两单体构成的人工合成凝胶丙烯酰胺（Acr）N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 作为电泳介质的优点作为电泳介质的优点自由调节孔径；韧性好；性质稳定；无电渗作用；无色透明。 合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法 化学合成系统化学合成系统过硫酸铵（AP）四甲基乙二胺（TEMED） 光学合成系统光学合成系统核黄素四甲基乙二胺（TEMED） 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续 聚丙烯酰胺凝
7、胶电泳的三个效应凝胶孔径不同缓冲液pH不同缓冲液离子成分不同浓缩效应电荷效应分子筛效应Gly -Pro -Cl- Gly - Pro - Cl- Cl- Cl- Cl- Pro -Pro -Pro -Gly -Gly -Gly -pHpH为为8. 8.3 3的电泳缓冲液的电泳缓冲液 （Tris-GlyTris-Gly）pHpH为为6.76.7的浓缩胶的浓缩胶pHpH为为8. 8.9 9的分离胶的分离胶有效泳动率：有效泳动率：MMClCl- - M M ProPro- - M M GlyGly- -Gly -Gly -Gly - Cl- Cl- Cl- Pro -Pro -Pro -快离子快离子
8、ClCl慢离子慢离子GlyGlyGlyGly pK1=3.24pK1=3.24 pIpI6.06.0 pK2=9.7pK2=9.7浓缩效应浓缩效应浓缩效应可显著提高电泳的分辨率由较低浓度的丙烯酰胺构成;浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分 离胶之前首先要经过浓缩胶;当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网 孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆 积”在浓缩胶和分离胶之间.浓缩胶还具有比分离胶更低的pH 浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,该pH远低于 Tris的pK值(8.1)。 分离胶内的缓冲溶液是pH 8.9的Tris-HCl， 电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.
9、3的Tris-甘氨酸缓冲溶 液。在浓缩胶中，分子量小，且带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的 移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速 率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形 成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负 电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动 。当样品进入pH 8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电 场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正 极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离 。分离主要依据分离主要依据蛋白质所带静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不 同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其
10、所带电荷相反的 电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量， 电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取 决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子 越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在 电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的 分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共 同影响，作用的结果。（三）、实验结果的分析 相关理论相关理论表表-1 -1 血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性种种 类类分子量（万）分子量（万）PIPI分分 布布(%)(%)清蛋白清蛋白 1-1-球球蛋白蛋白 2-2-球
11、球蛋白蛋白 - -球球蛋白蛋白 - -球球蛋白蛋白6.96.95.05.09.09.0 13.013.011.011.06.16.17.37.36.86.87.67.6 8.08.055552.130.82.130.84.172.54.172.51.2251.225 15.615.6前清蛋白前清蛋白清蛋白清蛋白 2-2-球球蛋白蛋白 1-1-球球蛋白蛋白 - -球球蛋白蛋白 - -球球蛋白蛋白紫外吸收测定蛋白质含量利用经验公式直接计算样本蛋白质含量 （P130）n器材 UV-752型紫外分光光度计 n试剂 (一) 蒸馏水 (二) 清蛋白(人或牛)纯晶 (三) 待测样本蛋白质操作步骤n用水稀释蛋
12、白质样本，稀释1-3倍，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。 n1、OD2800D2601.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mgm1)1.5OD2800.75OD260n2、OD280OD260 1.5时，用Lamber-Beer定律计算： 样本蛋白质含量(mgm1) = OD280（KL）（OD2806.31）10gL 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm6.3（100mlcm.g） K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数； L：溶液厚度标准曲线标准液编号蛋白质浓 度（mg/ml）OD28010020.1250.07530.2500.13840.3750.21250.5000.27660.6250.35170.7500.41281.0000.554【方法评价】n操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。n但核酸含量小于20或溶液混浊、则测定结果误差较大。n公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm 及260nm处的光吸收值也不尽相同，不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故计算结果有一定误差 。如果设定标准管，则应与测定管的蛋白质氨基酸组 成应相似，以减小误差。
