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1、第四章 核酸操作基本技术v4.1 凝胶电泳技术v4.2 核酸的提取和纯化v4.3 DNA测序技术v4.4 PCR技术v4.5 核酸分子杂交4.1 凝胶电泳技术4.1.1 凝胶电泳概述 1.定义：凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段、检 测扩增效果的常用技术方法。v电泳：带电的胶体粒子或分子在电场作用下的定 向移动。v迁移率：带电颗粒在一定电场中，单位时间内在一定介质中的迁移距离。 2.原理：v通过电泳分离提纯生物大分子的基本原理：由于不同生物大分子的带电性质不同，分子量大小也不一样，在同一电场条件下，其移动方向和迁移率是不同的，因而通过电泳就可把不同类型的生物大分子分开。v核酸分子中由于含有离子
2、态的磷酸基团而带负电荷，当核酸分子放置在电场中时，它们会向正电极的方向迁移。3.电泳的种类：按有无固体支持物来分：没有固体支持物的称为自由电泳（如：细胞电泳、柱电泳等）;常用的有支持物的电泳有淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。 4.1.2 琼脂糖凝胶电泳应用： 测定DNA的分子量 分离大小不同的DNA片段 进一步纯化DNA 分离鉴定RNA v琼脂糖由红色海藻产物琼脂提取，将琼脂糖粉末加入TBE熔 解后冷却凝固即成凝胶v其分辨能力和浓度有关：浓度低，能够分辨大片段DNA；浓 度高，能够分辨小片段（几百bp）DNA。v通过EB染料染色DNA来检测凝胶中DNA谱带部位。 EB（溴化
3、 乙锭）是一种扁平分子的嵌入性染料，能插入到DNA分子的 相邻碱基之间，并在300nm紫外线照射下发出荧光。琼脂糖凝胶电泳中影响DNA迁移速度的因素：（1） DNA的分子大小 大，慢；小，快 （2）琼脂糖浓度 高，慢；低，快 （3）DNA分子构象 超螺旋环状线性 （4）电源电压 低？高？ （5）嵌入染料的存在 （6）离子强度影响4.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳应用：蛋白质的分离核酸的分离DNA测序与琼脂糖凝胶电泳比较？4.2 核酸的提取和纯化v基本要求： 保持核酸分子一级结构的完整性 去除杂质 4.2.1 基因组DNA的提取和纯化v基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(
4、包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。提取方法：v核酸从cell中释放出来的方式：研磨 超声波 匀浆 冻溶 溶菌酶 v加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子 DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将 其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于 壁上及底部, 从而达到提取的目的。注意事项：v（1）在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。v（2）一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在
5、100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。v（3）不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。v（4）在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考
6、虑除去多糖和酚类物质。提取步骤（以植物为例）v在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液, 60水浴预热。 v植物幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状 后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60水浴保 温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 v加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防 止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分 层(必要时可重新混匀)。v室温下5000rpm离心5分钟。 v仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇, 混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 v在1.5ml eppendorf
7、中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮 团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解 于TE。 v如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀 移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60水 浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 v将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管 。v加入5l RNaseA(10g/l), 37 10分钟, 除去RNA(RNA 对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 v加入1/10体积的3mol/L NaAc及2体积的冰乙醇,混匀,- 20放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。v
8、用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 v将DNA重新溶解于1ml TE, -20贮存。 v 纯化方法：v如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子 DNA多, 会影响后续的分析和操作,可以用下列方法 纯化： （1）选用幼嫩组织，可减少淀粉类的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子 DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可 用作文库构建)。 4.2.2 RNA提取和纯化 关键因素：抑制RNA酶的活性 两条途径：提取多聚核糖体，利用抗原抗体反应，得到mRNA提取总RNA
9、- Oligo(dT)-纤维柱层析- 将mRNA与其它RNA分开 注意事项器皿都要严格消毒要加RNA酶的抑制剂(焦碳酸二乙酯)(DEPC)戴塑料手套v模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。v所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用
10、0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。v细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。v分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素
11、柱,可得到较纯的mRNA。v纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。v从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。vcDNA合成及克隆的基本步骤包括：用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。4.2.3 质粒DNA的分离、纯化 v质粒(Plasmid)是一种染色
12、体外的稳定遗传因子,大小从1- 200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在 于宿主细胞中。v质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复 制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所 携带的遗传信息。v质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质 ，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以 正常存活。v质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性 等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 v质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent cont
13、rol)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。v把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。v质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内
14、切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。v一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。质粒DNA的分离从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和裂解细胞;（3）分离和纯化质粒DNA。v采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS
15、)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。v在提取质粒过程中，除了
16、超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比线状和开环分子的泳动速度快。 4.3 DNA测序技术v4.3.1 双脱氧链末端终止法基本原理：vDNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成互补链vDNA聚合酶能够利用2,3-双脱氧核苷三磷酸作底物，将其掺入到寡核苷酸链的3末端，从而终止DNA链的生长。v反应体系：模板DNA、放射性标记的引物、DNA聚合酶、4种dNTP和一种ddNTP.末端终止原理：在DNA测序反应中，加入模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一种ddNTP
