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1、马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话：62336016；Email:,现代微生物学实验技术,实 验 内 容, 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 转座子随机突变及目的表型的筛选 大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取,利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性牛伯庆 王子元,实验目的,了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白的原理；掌握SDS-PAGE的原理、实验操作过程及重要性。,基因的基本结构,ORF：Opening Reading Frame,实验原理,影响基因表达的因素：启动子： 控制基因表达
2、的第一步，是高表达的关键；结构基因：密码子偏好性；表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。,实验原理,目的基因：受噬菌体T7强转录、翻译及终止信号控制；Lac操纵子；T7 RNA聚合酶启动；IPTG诱导；有His-tag标签；大肠杆菌BL21，,实验原理,操纵基因,结构基因,调节基因,启动子,阻遏物,-半乳糖苷酶,透性酶,乙酰基转移酶,乳糖操纵子,实验材料,菌株 pET28a-54/BL21(DE3)，pET28a-cho/BL21(DE3)，pET28a/BL21(DE3)2. 培养基及试剂(1). 培养基： LB液体培养基(2). 电泳溶液凝胶贮存液： 丙烯酰胺 29g；甲叉
3、丙烯酰胺 1g，加水至100ml，置于棕色瓶中，4存放。B. 8浓缩胶缓冲液： 1mol/L Tris-HCl,pH6.8, 4存放。,C. 4分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tis-HCl,pH8.8, 4存放。D. Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris 3.03g, 甘氨酸 14.4g，SDS 1.0g，pH 8.3，4存放。E. 上样缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),100 mmol/L 巯基乙醇， 2%(m/v) SDS,0.1% 溴酚蓝，10% (v/v)甘油。F. 10% SDSG. 10% 过硫酸铵H. TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺3
4、. 仪器设备 垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等,实验步骤,1. 菌种的活化及酶的诱导表达菌种活化：分别挑 pET28a-54/BL21(DE3)、pET28a-cho/BL21(DE3)、pET28a/BL21(DE3)单菌落于5ml LB+Km液体培养基37培养18h。酶的诱导表达：1%的接种量转接于20ml LB+Km液体培养基37培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30摇床振荡培养2-6h，以空载体为对照。,2. 融合蛋白的可溶性分析：(1). 12000rpm 离心收集菌体，溶于无菌水中；(2). 超声破碎菌体：功率 200W，4
5、sec，破碎90次，至菌液澄清；(3). 12000rpm离心5min收集上清；(4). 将沉淀悬于无菌水中；(5). 分别取上清、沉淀做样品处理及SDS-PAGE分析。3. 样品处理： 向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20保存。,4. 电泳制胶 点样 电泳 染(脱)色,表 分离胶与浓缩胶的配制,注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED,制胶： 事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。点样： 小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40l。注：一定要记住点样顺序电泳： 稳压，浓缩胶电压 60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电泳3-4小时，至指示剂溴酚蓝到达底部。染(脱)色：按照说明书操作,实验结果,电泳结果图片说明你认为整个实验过程中有哪些注意事项,
