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1、肿瘤药物敏感实验1化疗的重要性自1946年Gillman和Phillip报道氮芥类 药物治疗造血系统肿瘤以来，化学治疗巳取 得很大的进步。目前化学治疗已使绒癌、恶 性淋巴瘤、睾丸精原细胞瘤、小细胞肺癌等 多种恶性肿瘤获得治愈的机会，大多数恶性 肿瘤能得到缓解，化疗在恶性肿瘤的治疗中 具有不可替代的地位。2肿瘤化疗的局限性肿瘤的化学治疗在半个世纪 以来，虽然取得显著进展，但临 床抗肿瘤药物治疗的总有效率并 不高，阻碍化学治疗取得更好疗 效的原因众多，主要包括： 3抗肿瘤药物研究表明，即使是相同 组织学类型的肿瘤对同一抗肿瘤药物 的反应也并不尽一致，对不同脏器或 不同组织学类型的肿瘤采用相同的用
2、药方案，效果更是千差万别。目前大 多数化疗是采用的对某种脏器既定的 联合方案,仍有一定的盲目性。1. 现行化疗的盲目性42.化学治疗的抗药性有些肿瘤对某些药物存在先 天耐药,还有些肿瘤经化疗缓解 ，肿瘤敏感株杀灭，耐药株成 为复发的根源，而且对以后的 化疗抵抗。53. 抗癌药物的毒性所有抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞 的同时，也杀伤正常的组织细胞，尤 其是增殖旺盛的骨髓造血细胞和胃肠 道细胞。期望通过增大剂量、增加用 药品种、缩短间隔时间的方法来提高 抗癌效果，则将进一步加重毒性作用 。6如何解决这些问题？肿瘤化疗个体化: 研究发现，根据药敏 检测结果指导选药，有效率可在原来固定 化疗方案的基础上提
3、高一倍以上，于是提 出了肿瘤化疗个体化的概念(即预见性化疗 )。根据个体肿瘤敏感性检测的结果，选用 敏感的药物的联合方案，无疑将会大大提 高肿瘤的治疗水平。7肿瘤药敏的可行性l七十年代细胞培养技术的突破，新型培 养材料、培养基的问世。l1983年Mosmann建立了MTT法，方法简便 ，设备要求不高，检测时间短，便于在 临床上广泛开展。l新的抗癌药不断问世，同一种肿瘤有多 种联合化疗方案可供选择。8肿瘤药敏的方法学l裸鼠皮下移植l裸鼠肾包膜下移植l裸鼠原位移植肿 瘤 细 胞 药 敏体内法体外法l染料排斥法l集落形成法l同位素法l四唑蓝比色法9裸鼠肾包膜下移植l裸鼠肾包膜下移植实验是肿瘤细 胞药
4、敏体内实验最常用的方法， 但由于裸鼠需要在无菌条件下饲 养，而且肾包膜下移植实验操作 复杂，实验周期长，不易在临床 广泛开展。10染料排斥实验l原理是细胞死亡后膜通透性增加，染 料通过细胞膜而使细胞着色，故通过 计数未着色细胞可计算出药物的杀伤 率。但由于某些受杀伤尚未死亡的细 胞也不易着色，故假阴性率较高。另 外在计数时主观的因素会出现较大的 误差，目前较少应用。11集落形成法l集落法(Human Tumor Cell Cloning Assay, HTCA）肿瘤组织由增殖和非增殖细胞组 成，其中仅有 1具有旺盛的增殖能力 ，是肿瘤浸润扩散和复发的根源。 这种 细胞具有形成细胞集落的能力,故
5、又称为 肿瘤干细胞。 测定肿瘤干细胞对药物的 敏感性符合临床药物治疗的需要。12集落形成法方法学l双层琼酯法：底层 加入0.5% 的琼脂培 养液, 上层加含肿 瘤细胞悬液的0.3 % 琼脂培养液。上层 培养液供肿瘤细胞 生长，下层防止细 胞贴壁及成纤维细 胞的过度生长。l玻璃毛细管法: 培养 基0.6ml，瘤细胞悬液 0.1ml,抗癌药0.1 ml, 1琼脂糖0.2ml加在 一起混匀后向玻璃毛 细管内加入50l，冷 却凝固后置37二氧 化碳培养箱内培养。13集落形成法的优点l抑制纤维母细胞的增殖，不受肿瘤细胞 以外的细胞的影响。l下层滋养层可加入各种辅助分子，更利 于肿瘤的生长。l直接测定药物
6、对肿瘤细胞中最活跃的成 分肿瘤干细胞的影响。14集落形成法的缺点l高纯度单细胞悬液的制备困难。l所形成的细胞集落并非都是肿瘤 细胞集落。l成功率低，有一定的难度。l培养周期长，需10天左右。15l放射性同位素标记 的核苷酸容易掺入 DNA和RNA分子中l放射性同位素发灵 敏度高，重复性好 。l时间短，可较快地 得到结果。l仪器设备要求高。l由于具有放射性，故 操作时需要一定的防 护措施。l废料需特别处理。放射同位素法3H的射线能量低，分辨率高，半衰期长达 12年,3H标记胸腺嘧啶核苷(3HTdR)为最常用。163HTdR掺入法用培养液调整细胞浓度为1105/ml。将 此浓度的细胞接种于微量培养
7、板，每孔 100l，每3孔为一组，加入100l含有化 疗药的培养基，培养52小时，加入20l 3HTdR,实验结束后，吸弃上清，加入0.3 胰蛋白酶消化细胞，用多头细胞收集器收 集细胞。最后用液体闪烁计数仪测定每分 钟脉冲数（CPM）值。17四唑蓝比色法（MTT法）l原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将四甲基偶氮唑 盐转化为蓝紫色结晶物(formazan)，用二甲亚砜 （DMSO）溶解后，可在酶标仪上记录吸光度。l优点:1.操作简便，设备要求不高，时间短。2.实验精确，重复性好，而且无主观人为因素影响，临床符合率85。3.成功率高，约为809018MTT法操作方法用培养液调整细胞浓度为1105/ml后接 种于微量培养板，每孔100，每组设三个平 行孔，加入100l 含有化疗药的培养基,置 培养箱内培养68小时，加入20l MTT后再 培养4小时,吸弃上清，每孔加二甲亚砜 200l,用微量震荡器震荡,使结晶产物充分 溶解，在自动酶标仪上比色，测出波长 570nm处的吸光度，最后计算细胞杀伤活性 。19MTT法注意事项l血供丰富的肿瘤组织在制取肿瘤单细胞悬 液时，大量的红细胞影响测定，可用红细 胞裂解液裂解红细胞。l有色的抗癌药物对吸光度有影响，可用同 浓度的药物作为本底，去除药物的影响。l吸弃上清时要注意不要吸掉结晶物，一般 要先离心，板底留约30l的培养基20谢 谢！21
