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1、 分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能 确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并 对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断 分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分第十三章 单基因疾病的分子诊断 分子诊断不仅广泛应用于单基因疾病、多基因疾病、感染性疾病和肿瘤疾病的诊断中，而且在症状前诊断、产前诊断、植入前诊断等各时期的检查中，以及在法医学、移植配型、耐药性研究、个性化治疗和预防医学检验中发挥着重要作用。分子诊断学的发展第一代遗传标志（RFLP） 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism）在人类基因组中，不少DNA
2、多态性发生在限制性 内切酶识别位点上，酶切该DNA片段就会产生长 度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。由于DNA分子产生突变，使某些限制性酶切位点 数增加、减少或移位，导致限制性酶切片段长度 发生改变。RFLP的优点： 1）无表型效应，其检测不受环境和发育阶段 的影响。 2） RFLP标记在等位基因之间是共显性的， 在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。 3）在非等位的RFLP标记之间不存在上位效 应，因而互不干扰。 4） RFLP标记源于基因组DNA的自身变异， 在数量上几乎不受限制。 RFLP的缺点： 1）酶切只能产生2-3个片段，可提供的信息 量有限。 2）有时需要用放射性同位素标记的
3、DNA片段 作为探针检测RFLP。 3） 无法克服RFLP多态信息含量低的缺陷。分子诊断学的发展第二代遗传标志（STR） 短串联重复序列（short tandem repeat）人类基因组DNA有3109bp，其中10%是 串联重复序列，称为卫星DNA（satellite DNA）。可分为大卫星、中卫星、小卫星 和微卫星。重复单位由2-6bp组成的叫微卫星，也称它 为短串联重复序列。 人类基因组DNA中平均每6-10kb就有一个 STR位点，其多态性成为法医物证检验、 个人识别和亲子鉴定的丰富信息资源。 STR标记主要位于非编码区，变异一般不 影响人体的结构与功能。 灵敏度高，ng级DNA就可
4、以有效扩增。 适用生物检材类型十分广泛，对古代DNA 也可检测。分子诊断学的发展第三代遗传标志（SNP） 单核苷酸多态性(single nucletide polymorphism)在基因组中，不同个体的DNA序列上的单 个碱基的差异被称为单核苷酸多态性。基因型：一个人所拥有的一对等位位点的类 型被称为基因型。（genotype） SNP的优点： 1）SNP在基因组中的分布广泛。 2）SNP在人群中是二等位基因性的，在任 何人群中其等位基因频率都可估计出来。 3） SNP是高度稳定的。 4）部分位于基因内部的SNP可能会直接影 响产物蛋白质的结构或基因表达水平。 5）易于进行自动化、规模化分析
5、，缩短了 研究时间。 遗传性疾病：由于人体的遗传物质发生改变所引起的疾病。 致病基因：能够导致遗传性疾病发生的基因。 遗传性疾病分为两类：单基因病、多基因病。单基因病：是指一种遗传病的发生只受一对等位基因控制，他们的遗传方式遵循孟德尔分离定律。 多基因病：两个以上基因的结构或表达调控的改变，如糖尿病、高血压、冠心病、骨质疏松症等。单基因疾病的三种遗传方式1. 常染色体遗传（autosomal inheritance）包括：常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传。2. X连锁遗传（ X-linked inheritance）包括： X连锁显性遗传和X连锁隐性遗传。3. 线粒体遗传（mitochond
6、rial inheritance）单基因疾病的三种遗传方式1. 常染色体遗传（autosomal inheritance）常染色体显性遗传疾病有Huntington病、脊髓小脑性共济失调型。常染色体隐性遗传疾病有镰状细胞贫血、苯丙酮酸尿症和先天聋哑型。单基因疾病的三种遗传方式2. X连锁遗传（ X-linked inheritance）X连锁显性遗传有遗传性肾炎、抗维生素D性佝偻病。X连锁隐性遗传：假肥大性肌营养不良、血友病、红绿色盲等。3 常见的线粒体疾病 肌阵挛性癫痫伴碎红纤维病(MERRF)是一种线粒 体脑肌病 Leber遗传性视神经病(LHON)是一种罕见的眼部 线粒体疾病 帕金森病（
7、PD）分子诊断的策略 直接诊断 基因多态性连锁分析 基因突变的定量诊断 直接诊断：直接检测导致遗传性疾病的各 种基因突变 类型：点突变缺失插入倍增 前提：基因已经克隆，序列和结构清楚点突变 点突变：DNA分子中单个碱基的替换 终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断 各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成(一)点突变的诊断 1、 基因背景清楚的点突变 等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide, ASO) 限制性片
8、段长度多态性分析PCR-RFLP 测序 基因芯片技术2、基因背景未知的点突变 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism, SSCP) 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 异源双链分析(heteroduplex analysis, HA) DNA序列测定 蛋白截短测试（protein truncation test, PTT） 片段性突变核苷酸的丢失和增多 缺失：基因中碱基（遗传物质）的丢失 插入：外来基因片段插入某一基因序列中 倍增：基因内部某一段序列发生重复一
9、、单基因遗传性疾病的基因诊断(二)片段性突变的检测 片段性突变是指DNA分子较大范围发生突 变， 碱基的缺失、插入、扩增和重组。 （1）少数核苷酸缺失或插入检测点突变的方法 （2）大的片段突变 Southern印迹技术、多重PCR技术。动态性突变以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。 脆性X综合征：CGG重复。少年脊髓型共济失调：GAA重复。一、单基因遗传性疾病的基因诊断二、基因多态性连锁分析 检测原理：多态性连锁分析、关联分析 检测前提：致病基因尚未被定位和阐明基因太大、突变种类太多 检测方法：RFLP，STR，S
10、NP三、基因突变的定量诊断 检测内容：大范围的重复、缺失 检测方法：细胞分裂中期染色体检测固相杂交PCR 扩增一、单基因遗传性疾病的基因诊断（二）遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断策略2.间接诊断策略（二）遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断策略基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。 一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.间接诊断策略 间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通 过分析可确定个体是否存在双亲同源染色体中的致病染色体 间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过
11、分析DNA的遗传标志的多态性估计被检者患病的可能性 一、单基因遗传性疾病的基因诊断 连锁分析(linkage analysis): 是通过用一系列覆盖密度适当的遗传标志在先证者家系中进行分析，从而找到与某一遗传标志紧密连锁的致病基因，并确定该基因在染色体上的位置。一、单基因遗传性疾病的基因诊断（三）基因诊断所采用的技术一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.基因表达异常的检测3.间接诊断所采用的技术1.直接诊断所采用的技术1.直接诊断所采用的技术Southern 印迹技术多重PCR技术PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等位基因特异性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技术（DNA chip）单
12、链构象多态性（SSCP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）DNA序列分析（DNA sequencing）一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.基因表达异常的检测定量PCR技术 DNA结合染料技术 水解探针技术 杂交探针技术一、单基因遗传性疾病的基因诊断3.间接诊断所采用的技术间接诊断就是分析DNA的遗传标志的多态性（1）限制性片段长度多态性（RFLP）第一代DNA的遗传标志，具双等位基因多态性，所含信息量有限 。 检测方法：Southern印迹技术、PCR-RFLP。一、单基因遗传性疾病的基因诊断（2）小卫星序列串联重复可变数目（VNTR），以 670bp 为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列，构
13、成数量可变的串联重复序列。等位基因常常达10个以上，信息量比 RFLP大得多 。检测方法：Southern 印迹技术、PCR技术 。一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断（3）微卫星序列 以 26bp 为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR) ，在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性，属于第二代的遗传学标志 。检测方法：PCR技术、基因扫描 。一、单基因遗传性疾病的基因诊断（4）单核苷酸多态性(SNP) 第三代DNA的遗传标志，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异，在人类基因组中的数目可达300万个，由34个相邻的标志便可构成816种单倍型，是
14、一种信息量非常大的标志系统 。检测方法：DNA芯片技术。一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断（四）遗传标志的选择 选择离致病基因最近的遗传标志 遗传标志离致病基因的距离越远，二者间发生重组的可能性越大，二者间距离为1cM(106bp)时，发生重组的概率为1% 一、单基因遗传性疾病的基因诊断（五）间接诊断的不确定性 遗传标志所带的信息有限 新突变 基因重组 家系成员不够完整一、单基因遗传性疾病的基因诊断二、单基因病的分子诊断单基因遗传病是由于某一基因结构的变化或由其而引起的基因表达异常而导致的疾病 单基因疾病的分子诊断一、血红蛋白病 二、血友病 三、肌营养不良症 四、苯丙
15、酮尿症 五、亨廷顿病 六、脆性X综合征血红蛋白病单基因病的分子诊断 血红蛋白病包括：镰状细胞贫血、地中海 贫血单基因病的分子诊断DNA片段在琼脂 糖凝胶上电泳分 离膜上固定DNA 片段在缓冲液中将 标记的探针加 到膜上DNA片段从琼脂 糖凝胶上转印到 膜上杂交信号的 检测Southern blot分子诊断（一）血友病A的分子诊断（二）珠蛋白合成障碍性贫血的分子诊断二、单基因病的分子诊断二、单基因病的分子诊断1.1.凝血因子凝血因子基因的主要遗传缺陷基因的主要遗传缺陷2.F基因的直接检测（22号内含子倒位检测） 3.F基因连锁分析（F基因st14位点多态性检测）（一）血友病A的分子诊断血友病血友
16、病A A1. 1. 凝血因子凝血因子基因的主要遗传缺陷基因的主要遗传缺陷主要为点突变和基因缺失缺失 169 种插入 28 种点突变 347 种第22号内含子倒位:40%50%重型HA 二、单基因病的分子诊断第22号内含子倒位的机制二、单基因病的分子诊断11kb/12kb/12kb/11kb/12kb2. F基因的直接检测22号内含子倒位检测 二、单基因病的分子诊断长距离PCR扩增22号内含子3. F基因连锁分析 F基因st14位点多态性检测B/A/B/CB/CC/DC/B/D二、单基因病的分子诊断PCR检测VNTR （st14）位点进行家系连锁分析血红蛋白异常包括两大类 结构变异：珠蛋白链上氨基酸序列发生改变如镰状细胞贫血 珠蛋白链合成障碍：
