微生物的实验室培养降解尿素和纤维素(用)

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1、专题 微生物专题微生物 概念及 分类微生物 培养微生物 分离和 计数微生物 应用一、微生物概念及分类1、概念：是指自然界中那些形态微小 、结构简单，通常要用光学显微镜或电 子显微镜才能看清楚的生物。第1节 微生物的实验培养生 物 分 类动物界：植物界：真菌界：原生生物 ：原核生物 ：病毒大型真菌、霉菌 酵母菌细菌、放线菌、 支原体、蓝藻、 衣原体变形虫、草履虫DNA型病毒 、RNA型病 毒真核生物原核生物非细胞生物细胞 生物小资料：小资料：乳酸菌每小时产生乳酸能达到 自身重量的成千上万倍；大肠杆菌每小时 分解的糖是自身重量的两千倍，每20分 钟可分裂一次，如保持这一速度，则两天 即可超过地球的

2、重量。 微生物的代谢为什么如此旺盛呢？ 微生物表面积和体积的比很大，约是同等重量 成年人的30万倍，使它们能迅速与外界环境进 行物质交换。二、微生物培养：1）概念：按照微生物对营养物质的不同需 要，配制出供其生长繁殖的营养基质。1、培养基：2）营养成分：概念分类作用 为微生物 的生长和 繁殖提供 所需碳元 素的营养 物质无机碳源：二氧化碳 、 碳酸氢钠； 有机碳源：葡萄糖、 脂肪酸、石油等 葡萄糖是最主要的碳 源合成微生物 的细胞物质 和代谢产物 ，有些碳源 是异养微生 物主要能源碳源：概念分类作用 为微生物 的生长和 繁殖提供 所需氮元 素的营养 物质无机氮源：N2、NH3 铵盐、硝酸盐；

3、有机氮源：尿素、牛 肉膏、蛋白胨等 铵盐、硝酸盐是最主 要的氮源。合成蛋白质 、核酸和含 氮代谢产物氮源：温度、PH、渗透压、O2及特殊营养 物质等。1、科学家们用脉胞霉（一种真菌）为材料，进 行科学研究，用基本培养基来培养脉胞霉。基 本培养基中所含的营养要素一般包括：_ 2、酵母菌可用于食品工业的废水处理，废水中 的淀粉或废糖可与为酵母菌的生长提供 _类营养物质。 3、用乳酸菌制酸奶，加入的蔗糖是作为_ 类营养物质加入到牛奶中的。 4、硝化细菌的碳源、氮源、能源依次为 _。碳源、氮源、水、无机盐碳源 碳源CO2、 NH3 、NH3氧化释放的化学能微生 物所 需的 营养 要素碳源氮源水无机盐无

4、机碳源：CO2等自养型有机碳源：葡萄糖等异养型N2：固氮菌（根瘤菌等）NH3：硝化细菌其他：铵盐、硝酸盐、尿素、蛋白胨特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等） 、PH、温度、氧气等3）培养基的种类物理性质培养基特点作 用固体培养基半固体培养 基 液体培养基加大量琼脂 加少量琼脂 不加琼脂 用于微生物的分 离和计数 观察微生物的运 动和鉴定菌种 用于工业生产3）培养基的种类化学成分培养基特点作 用合成培 养 基天然培 养 基化学成分、 含量已知含有天然物质 ，化学成分、 含量未知用于微生物的分 类和鉴定用于工业生产3）培养基的种类 用 途培养基成 分原理作用实例选择 培养 基 鉴别 培养 基基本培

5、养 基+某种物 质基本培养 基+指示 剂或化学 物质抑制不需要； 促进需要微 生物生长发生特定颜 色反应等， 证明微生物 的存在分离 菌种鉴别 菌种青霉素选 择出霉菌 和酵母菌伊红-美蓝 遇大肠杆菌 落呈深紫色 带金属光泽选择培养基1）不加碳源的培养基 分离自养型微生物 2）不加氮源的培养基 分离固氮菌 3）加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 4）加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌练习：（10全国）某细菌固体培养基的组 成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、 葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固 剂是，碳源是， 氮源是。已知只有能合成脲酶 的细菌才能在该培养基上生长

6、，故该培养 基属于培养基。按照化学成分分 类，该培养基属于培养基。从同化 作用类型上看，用该培养基培养的细菌属 于。葡萄糖 尿素琼脂选择 合成异养型思考：自然界中微生物是混杂的生活在 一起的，如何分离出某种微生物（如纯 化大肠杆菌）？2、实验操作大肠杆菌的纯化培养1）制备培养基：计 算称 量溶 化调 PH 值灭 菌倒 平 板无菌技术1、获取纯化培养物的关键是防止外来杂菌 的入侵。2、无菌措施： 1)对实验操作空间、操作者衣着和手进 行清洁和消毒；对将培养用的器皿、 接种工具和培养基进行灭菌2)实验操作时已灭菌材料等应避免与周 围物品接触；实验操作应在酒精灯火 焰附近进行；接种工具等应在酒精等

7、火焰上灼烧后使用1)概念：用温和的物理方法和化学方法杀 死物体表面或内部一部分对人体有 害的微生物（不包括芽孢和孢子）消毒与灭菌消毒：2)常用消毒方法：煮沸消毒法:100煮沸5-6min；巴氏消毒法:70-75 下煮30min或 80 下煮 15min；化学药剂消毒法:用75%酒精等进行皮肤消 毒;氯气消毒水源；紫外线消毒等灭菌 1)概念：用强烈的物理方法和化学方法杀死 物体表面或内部所有的微生物（包 括芽孢和孢子）灼烧灭菌干热灭菌：160- 170 下加热1- 2h。高压蒸汽灭菌： 100kPa、121 下维持15-30min.2)灭菌方法：无菌技术1、获得纯净培养物的关键是？防止外来杂菌的

8、入侵 2、消毒与灭菌的区别？消毒是杀死部分对人体有害的微生物；灭菌是杀死所有微生物。 3、对培养基灭菌的方法是_， 对接种针灭菌的方法是_，对玻璃器 皿灭菌的方法是_，对实验操作者的手 用酒精_处理，实验操作结束需不需要 灭菌？_高压蒸汽灭菌法 灼烧灭菌 干热灭菌 消毒 需要倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。平板倒置原因：防止培养基冷却产生水滴滴落培 养基上，造成污染。2、实验操作大肠杆菌的纯化培养1）制备培养基：计 算称 量溶 化调 PH 值灭 菌倒 平 板原则：目的明确、营养协调、PH值适宜2）纯化大肠杆菌：微生物接种方法平板划线法稀释涂布平板法平板划线法：通过接种环在琼脂固体

9、培养基表面连续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在 数次划线后培养，可以分离到由一个细 胞繁殖而来的细胞群体，即得到单一菌 落。平板划线法稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后 将不同稀释梯度菌液分别涂布在固体培 养基的表面，进行培养。在稀释度足够 高的菌液里，聚集在一起的微生物将被 分散成单个细胞，进而形成单个菌落。系列稀释操作123456(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中， 轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试 管中，重复步骤2，直至到第六支试管

10、。10-110-410-510-6平板划线法稀释涂布平板法 相同点：分散出单细菌形成单菌落来分离菌种 不同点：分别通过划线和稀释分散出单细菌，稀释涂 布平板法除分离菌种外还可以对微生物计数三、微生物的分离和计数思考：如何寻找和分离某种微生物？实例实例1 1：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。多聚酶链式反应是一种在多聚酶链式反应是一种在 体外将少量体外将少量DNADNA大量复制大量复制 的技术，此项技术要求使的技术，此项技术要求使 用耐高温（用耐高温（93930 0C C）的）的 DNADNA

11、聚合酶。聚合酶。如果让你寻如果让你寻 找这种耐高温的酶，你会找这种耐高温的酶，你会 去哪找？去哪找？启示：启示：分离菌种要人为提供有利于目的菌株生分离菌种要人为提供有利于目的菌株生 长的条件长的条件( (包括营养、温度、包括营养、温度、pHpH等等) )，同时抑制，同时抑制 或阻止其他微生物生长，即用或阻止其他微生物生长，即用选择培养基选择培养基来分来分 离菌种。离菌种。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大 多数微生物，只有耐热菌被筛选出来。多数微生物，只有耐热菌被筛选出来。思考：为什么耐热菌能从热泉中被筛选出思考：为什么耐热菌能从热泉中被筛

12、选出 来？来？（一）分离微生物原理：选择培养基分离（一）分离微生物原理：选择培养基分离1 1、活菌计数法（通过统计菌落估算活菌数）、活菌计数法（通过统计菌落估算活菌数） 原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养在稀释度足够高时，微生物在固体培养 基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而 成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均代表某一稀释度下平板上生长的平

13、均 菌落数，菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体代表涂布平板时所用的稀释液的体 积积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。（二）微生物计数方法（二）微生物计数方法 ：注意事项注意事项 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因 是是_ _。 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030 300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。( (细菌：稀释度细菌：稀释度10104 4- -10106 6；放线菌：稀释度；放线菌：稀释度10103 3-10-105 5；霉菌：稀释度；霉菌：稀释度10102 2-10

14、-104 4) )为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出 菌落平均数。菌落平均数。当两个或多个细胞连着一起时，平板上观 察到的菌落只有一个。2 2、显微镜直接计数法、显微镜直接计数法 ：利用特定利用特定细菌计数板细菌计数板或或血细胞计数板血细胞计数板，在显微，在显微 镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；

15、 个体小的细菌在显微镜下难以观察个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点缺点1 1、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（三）实例：课题背景课题背景 1 1）尿素的利用）尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接 被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成分解成 氨氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2）细菌利用尿素的原因）细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶 + H+ H2 2O O+ CO+ CO2 2NHNH3 33 3）常见的分解尿素的微生物）常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏 杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些杆菌、棒状杆菌、梭状