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1、Chapter 3 DNA replication一、DNA的半保留复制（semiconservative） 1、半保留模型的提出：1953 Watson PriA (some phage)2. 单链结合蛋白（single strand binding protein, ssb）作用：防止单链退火（在原核细胞中表现出协同效应）3. 引发酶（primase）Dna G (E. coli )引发体 Primosome4. DNA连接酶（DNA ligase）需要能量NAD（E. coli ）/ ATP（真核）5. DNA螺旋酶（DNA gyrase）- 拓扑异构酶断裂双链引入负超螺旋 （swive
2、l function)需要ATP6. DNA聚合酶（DNA polymerase, Pol） Three DNA Polymerases （E. coli） （1）Pol IDNA聚合酶3 5 核酸外切酶（校对）5 3 核酸外切酶（损伤修复、去除引物）缺口填充 （大缺口） DNA 损伤修复缺刻平移 Nick translation（去除引物） （2）Pol II 活性很低，不是DNA复制必需的 （3）Pol III 3 5 核酸外切酶 （校对） 亚基DNA聚合酶（必需） 亚基（dna E）缺口填充（小于100bp）讨论：1、Pol I and III功能上有哪些相同点？2、 Pol I and
3、 Pol III功能上有哪些不同？（4）Pol I and Pol III相同的功能特点：1 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成DNA2 需要模板(3 5)和引物的存在3 不能从头合成新的DNA链（必须有3 -OH末端）4 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端5 催化DNA合成的方向是5 3 6 有 3 5 核酸外切酶活性（校对功能）（5）Pol I and Pol III不同的功能特点：1 5 3核酸外切酶活性不同。2 Pol I 可进行缺刻平移、去除引物。3 二者聚合酶活性不同，Pol III是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。4 Pol I 主要功能是进行D
4、NA 损伤修复。Composition of E. coli DNA Polymerase III HoloenzymeSubunitFunctionSubassembliesDNA polymerase 3- to 5- exonucleaseCore Stimulates exonucleasePol III Dimerizes core Binds complex Binds ATP Binds to PolIII Binds to and complex Binds to SSB( DNA-dependent ATPase ) Binds to and Sliding clamp六、D
5、NA聚合酶III1、亚基（1）结构：环状的二聚体（2）作用：“活动夹板”允许全酶沿着DNA滑动使全酶的持续性很高2、DNA聚合酶III-形成不对称的二聚体使前导链、滞后链的合成可同时进行后滞链模板形成了 一个回环，使环中 RNA引物和冈崎片段的合成方向与前 导链一致，以适应 双链在同一复制体 上进行复制3、回环模型“”型复制环状DNA的复制方式，即从复制起点开始 ，双向同时进行，形成样中间物环节：DNA复制的起始DNA链的延伸 DNA复制的终止 第二节 细菌DNA复制一、细菌DNA复制起始（一）复制起始复合体 DnaA（起始点结合蛋白)DnaB（解旋酶）SSBDnaC（装载解旋酶和引发酶）HU
6、（识别并刺激OriC 形成开链）Gyrase（促旋酶）-拓扑异构酶（二）复制起始区的结构特点1、富含AT2、3个13bp的重复序列-解链的位点3、4个9bp的重复序列- DnaA结合位点（三）复制起始引发的过程：1、DNA复制起点双链解开 ，形成复制叉GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA+ATPDnaBDnaCOriC（富含AT ）313bp重复序列49bp重复序列DnaA结合位点HU +ATPATP过程：（1）约20个DnaA结合在49bp重复序列（2）DnaA复制起始复合物使13bp重复序列变性，形成开链（3 ）DnaB与单链DNA结合（需要DnaC帮助），进一步解开DNA
7、双链，形成复制叉2、RNA引物的合成 leading strand: primase（引发酶）lagging strand: primosome 引发体（引发前体primase）引发前体：n蛋白、n蛋白、n”蛋白、i蛋白、 dnaB蛋白和dnaC蛋白 3、DNA聚合酶将第一个dNTP加到引物的3-OH末端 SSBDnaG primaseDnaB helicasePol III （ /）引发体（primosome）Pol I、ligase复制体（replisome） in vivo二、细菌DNA复制延伸（二）DNA聚合反应的特征 1、DNA的聚合反应是以dNTP为底物，以3 5 DNA为模板，按
8、碱基配对原则在3-OH上加dNTP（DNA聚合酶对碱基的选择功能） 2、需二价正离子如Mg， 3-OH作亲核进攻形成磷酸二酯键 3、链沿5 3方向延长 4、碱基互补配对，若错配则切除掉（一）DNA复制体(replisome) DNA聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体（三）防止拓扑学问题两种机制1DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋 所中和2DNA拓扑异构酶可以打开一条链，使正超螺旋 状态转变成松弛状态；DNA拓扑异构酶(旋转酶) 可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双 链DNA nick结合Pol I引物移动 / DNA合成
9、封闭缺口降解的引物DNA ligase（四）缺刻平移( Nick translation)去除引物5 5 3 3parent progenyAATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAACATTGATTTCAterD / terAterC / terBReplication fork 1Replication fork 2tus gene 产物复制终止区：200 kb（DnaB inhibitor)复制叉相遇位点三、细菌DNA复制的终止Topoisomerase IV：使复制叉解体，释放子链DNA（三）分离（segregation）（一）终止位点一侧复制叉的终止位点位
10、于相遇点的另一侧（二）终止机制1、Tus蛋白的作用：可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移2、两个复制叉在相遇点相遇3、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇第三节 真核生物DNA复制一、概述 （一）复制与细胞周期S期早：常染色质，中：异染色质，晚：着丝粒和端粒（二）复制频率每个细胞周期复制一次（三）复制与核小体1、 复制叉形成时DNA从核小体解离，组蛋白八聚体解聚2、复制叉通过后新、旧组蛋白与DNA重新组装成核小体成熟前起始（快速生长的原核细胞内 ）二、真核生物DNA复制的起始（一）复制起始点（多个）酵母：自动复制序列 （ARS）特点：11bp的保守序列（富含AT）（起始位点识别复合体 ORC
11、）（二）复制子簇（cluster of replicons）特点1、由多个复制子组成，20-50个串联排列2、同一复制子簇内的复制子基本同步起始三、真核生物DNA复制的延伸（一）相关酶和蛋白质1、解旋酶（RP-A，replication protein A）2、单链结合蛋白3、连接酶 I（DNA ligase I）4、PCNA（proliferating cell nuclear antigen）-增殖细胞核抗原与Pol 向Pol 的转换有关5、聚合酶（二）真核生物DNA聚合酶1、 DNA Pol （作用：复制的引发）复合体（ Pol /引发酶）（1）引发酶活性合成前导链和每个后随链每个片段的
12、RNA引物（2）53聚合酶活性可继续延长DNA（a few hundred nt）但很快被 Pol 代替2、 DNA Pol （作用：前导链、滞后链延长，校对功能）（1） 53聚合酶活性（2） 3 5 核酸外切酶活性Probable Roles of Eukaryotic DNA PolymeraseEnzymeProbable roleDNA polymeraseoriginate DNA replicationDNA polymeraseDNA replication: leading strandlagging strandDNA polymerase Unknown, structur
13、e similar toDNA polymeraseDNA repairDNA polymeraseReplication of mtDNA四、真核生物DNA复制的终止1、终止位点：不存在使复制叉终止和解聚的终止位点(Termini)2、终止机制：复制终止通过复制叉的相遇而终止一、线状DNA末端复制问题53535 3535 55第四节 线状DNA的末端复制线状DNA末端复制问题1、复制后产生粘性末端（sticky end）：滞后链的5端引物切除后，因没有3-OH存在 DNA聚合酶无法将缺少的部分补齐2、染色体不稳定3、染色体末端隐缩：DNA每复制一次，DNA 就缩短一次讨论：环状DNA是否存在
14、末端复制问题？二、T7 噬菌体DNA的末端复制5 35 33 53 55 33 55 33 5互补的3端配对5 33 5聚合酶I和连接酶 封闭缺口限制性酶 交错切割 5 33 5聚合酶I 3延伸,完成复制真核生物如何解决末端复制的问题?三、真核生物染色体 DNA末端复制 （一）端粒（Telomere）1、概念：是真核生物染色体末端的一种特殊结构2、组成：端粒DNA / 端粒蛋白（1）端粒蛋白 ：非组蛋白（2）端粒DNA ：a、含数百个短的正向重复序列，富含GCb、通式：Cn（A/T）m n1，m=1-4人的端粒DNA序列：（ TTAGGG）n3、作用（1）稳定染色体结构（2）防止染色体末端融合
15、（3）保护染色体结构基因（4）避免遗传信息在复制过程中丢失附：端粒长度-分子钟(molecularclock) 的作用随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发生凋亡（apoptosis）（二）端粒酶1、组成（1）蛋白质：逆转录酶（2）RNA：约150nt，部分序列与端粒DNA互补， 可作为合成端粒DNA的模板（端粒酶是自身携带RNA模板的逆转录酶）2、功能：负责端粒DNA的延长，维持端粒的长度3、存在部位：在干细胞、生殖细胞和肿瘤细胞， 才可以检测到具有活性的端粒酶4、端粒酶和衰老、肿瘤有关（三）端粒DNA的复制1、已存在的端粒DNA的复制：与其它部分DNA复制一起完成2、端粒DNA的延长主要由端粒酶完成（1）G链（G-rich strand）的合成（2）C链（C-rich strand）的合成.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC AACCCCAAC53 35dGTP.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT .AACCCCAACCCC AACCCCAAC53 35dGTP.TTG
