结核病有关新进展

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1、 结核病有关新进展西南医院呼吸科 胡建林结核病一直是发展中国家 较严重的传染病，1985年以来 艾滋病的流行、结核感染者的 涌入等原因便美国等欧美发达 国家结核病发病率呈回升趋势 ，尤其是结核病耐药问题使结 核病治疗更是雪上加霜。目前 全世界有结核病人约2000万， 每年新增结核病人8001000万， 每年死亡人数约300万;我国的 结核病疫情也相当严重，2000 年第四次全国结核病流行病学 调查结果表明我国有结核病人 500万，每年死亡人数约23.8万 ，结核病死亡在我国各种死亡 原因中居第十一位，在传染病 中居第一位。1993年世界卫生组 织(WHO)采用特别步骤宣布结核 病全球告急。面对

2、这种严峻的 形势，结核病的预防和治疗已 引起国内外学者的高度重视。简述：结核病DNA疫苗结核病诊断分型诊断方法进展抗结核药物进展 结核病耐药问题结核病DNA疫苗目前用于结核病预防的疫 苗是卡介苗(BCG)，它自1921年 以来就一直被用于人类结核病 的预防，但经过半个多世纪的 临床对照试验研究，BCG对肺结 核的免疫保护力是080%，差 异很大，1995年WHO总结出BCG 不是预防肺结核的有效疫苗。此外，对于免疫功能缺陷的病 人，BCG接种有可能导致全身播 散。因此，有必要研制新疫苗 。1990年Wolff等在一次基因 治疗的实验研究中意外地发现 不加任何处理的基因也可在骨 酪肌细胞中表达蛋

3、白至少2个月 。1992年Tang等报道人生长激 素编码基因的重组质粒接种小 鼠后，可诱发机体产生抗人生 长激素抗体。1993年Ulmer等首 先报道用甲型流感病毒基因免疫 小鼠，不仅可表达蛋白，刺激 机体产生特异性免疫应答，还 可保护小鼠抵抗异株流感病毒 的攻击。至此，产生了核酸疫 苗(Nucleic Acid Vaccine)或 基因疫苗(Genetic Vaccine ) 、基因免疫(Genetic immunization)、核酸免疫(Nucleic Acid Immuniztion) 的全新概念，开创了免疫学和 疫苗学的新领域。核酸疫苗(Nucleic Acid Immuniztio

4、n)包括DNA疫苗和 RNA疫苗，由能引起机体保护性 免疫反应的病原体抗原的编码 基因和真核表达载体构建而成 ，它被注入机体后，通过宿主 细胞的转录系统表达蛋白抗原 ，诱导宿主产生细胞免疫应答 和体液免疫应答，从而达到预防 和治疗疾病的目的。由于RNA疫 苗不稳定，在体内存在时间短 ，表达短暂，生产、贮存、运 输比DNA疫苗要求高, 因此，目 前研究最多的是DNA疫苗，其不 需要任何化学载体，故又称为 裸DNA疫苗（Naked DNA Vaccine）。几个流感、艾滋病、乙型肝 炎、疟疾、结肠癌、T细胞淋巴 瘤等DNA疫苗在美国和欧洲已进 入或期临床试验。1996年 以来WHO将结核病核酸疫苗

5、研究 列为资助的项目之一。一、结核病DNA疫苗的研究现状DNA疫苗可诱导全面的免疫 反应，尤其是特异性CTL可识别 、杀伤、破坏被感染的细胞及 清除细胞内的病原体，这对于 消除寄生于巨噬细胞内的结核 分支杆菌非常有意义。结核病 DNA疫苗的研究正日益深入。(一)结核病预防性DNA疫苗迄今大约有以下结核病预防 性DNA疫苗在动物实验中获得了 较理想的效果。1Ag85复合物编码基因； 2 Pst S编码基因； 3ESAT6编码基因和MPT64编码基因 ； 465kDa热休克蛋白(hsp60)编码基因 ； 5Hsp70编码基因； 636kDa编码基因； 7 19kDa或ahpC编码基因; 8.22k

6、Da编码基因; 9.HsplO编码基因;(二)结核病治疗性DNA疫苗目前用于结核病治疗的免 疫调节剂主要有二类:一类是非 特异性的如IFN-Y、IL-2、IL- l2等细胞因子;另一类是特异性 的母牛分支杆菌菌苗(商品名维 卡菌苗)，是由母牛分支杆菌经 高温灭活后冻千制成的。由于 前者半衰期短，费用高;而后者是死菌只能诱导体液免疫和Thl 型细胞应答;不能诱导特异性 CTL应答。DNA疫苗在细胞内生 成内生性抗原，不仅能诱导体 液免疫和Thl型细胞应答，还能 诱导特异性CTL应答。因此，结 核病DNA疫苗不仅有可能成为结 核病预防性疫苗，还可能成为 治疗性疫苗。1999年Lowrie等首次将h

7、sp6O 、hsp7O和ESAT6质粒DNA疫苗用 于小鼠结核病模型的治疗，以 BCG质粒载体和生理盐水为对照 ，hsp6O和hsp7ODNA疫苗诱导产 生的IFN-7水平显著高于BCG、 质粒载体和生理盐水对照组， 并使免疫小鼠脾、肺菌落计数 显著低于其它各组;但ESAT-6DNA 疫苗的治疗效果不是很明显。 hsp6ODNA疫苗还可使结核病化 疗后体内残余的菌数显著减少 。该研究结果证明了某些结核 病DNA疫苗作为特异性免疫调节 剂的可能性。但IL-l2的表达质 粒与hsp60DNA疫苗联合注射未能观察到协同效应，其肺和脾 菌落计数均比它们单独免疫的 高。目前关于结核病治疗性DNA 疫苗的

8、研究报道还不多，由于 采用的小鼠模型不同，而且小 鼠对结核分支杆菌不敏感，因 此，各研究结果也不尽相同。(三)制备抗血清DNA疫苗免疫后可激起机 体产生体液免疫应答，产生高 效价的特异性多克隆抗体，从 而为抗血清的制备开辟了一条 简便、快速的新途径。(四)DNA疫苗可能的免疫学机理DNA疫苗的免疫学机理尚 不十分清楚。结核病DNA疫苗被 导人宿主骨酪肌细胞内，并在 细胞内表达结核菌蛋白抗原， 加工后形成多肽抗原，与宿主 细胞MHC I类和MHC 类分子结 合，被呈递给宿主的免疫识别 系统，从而引发特异性细胞和体液免疫应答。一般认为激活 Thl辅助T细胞和CD8+CTL是机体 建立结核病保护性免

9、疫所必需 的。DNA转入肌肉细胞后引起免 疫应答的机理目前有二种假说 :(1)外源性DNA在肌细胞中表达 ，肌细胞分泌或死亡后释放所 表达的蛋白，进入血液循环后 刺激抗体产生。(2)骨髓来源的 抗原提呈细胞(APC)摄入肌细胞 局部释放的抗原，而后通过MHCI类分子提呈给T淋巴细胞， 诱导出CTL反应。即使有了活跃 的CTL存在，多数表达抗原肌细 胞因其表达的MHCI类分子水平 很低，不被CTL溶解破坏，从而 长期表达抗原，持续刺激免疫 系统。这可能是DNA疫苗肌肉注 射后能长时间维持免疫的原因 。DNA疫苗具有较长的免疫记 忆能力，其机制尚不清楚，可 能是因为它在体内相当于抗原 的储存库，不

10、仅刺激免疫记忆 ，本身就有免疫记忆能力。 Kamath等的研究表明DNA疫苗免 疫后，可使分泌干扰素的T细 胞较早出现，并使其反应增强 。(二)DNA疫苗的安全性DNA疫苗的安全性还存在一 定争议。虽然目前所有动物模 型研究均己证明DNA疫苗安全有 效，但没有足够的依据能排除 理论上可能的危险性，还需进 一步建立合适的方法检测、排 除下列危险性的存在。1可能整合人宿主细胞 基因组。通过甲基化分析，酶 切分析和PCR技术等研究表明， 进入骨酪肌细胞的DNA分子独立 存在于细胞质中，未发现复制 或整合。2可能引起免疫系统功 能紊乱：(l)诱导产生抗自身 DNA或抗自身组织细胞的抗体， 引起自身免疫

11、性疾病。，(2)少 量表达的抗原可与诱导产生的 抗体形成复合物，引起免疫抑 制。(3)诱导机体产生特异免疫 耐受。结核病诊断分型 （1999年结核病分类标准）1原发型肺结核:为原发结 核感染所致的临床病症，包括 原发综合征及胸内淋巴结结核 。2血行播散型肺结核:包括 急性血行播散型肺结核(急性粟 粒型肺结核)及亚急性、慢性血 行播散型肺结核。3继发型肺结核:是肺结核 中的一个主要类型，包括浸润 性、纤维空洞及千酪性肺炎等 。4结核性胸膜炎:临床上己 排除其它原因引起的胸膜炎。 包括结核性干性胸膜炎、结核 性渗出性胸膜炎、结核性脓胸 。5其它肺外结核:按部位及 脏器命名，如骨关节结核、结 核性脑

12、膜炎、肾结核、肠结核 等。诊断方法进展： 噬菌体裂解法快速鉴定结核分 支杆菌分支杆菌噬菌体在1947年 首次分离，至今已分离出250余 种。近20年来，分支杆菌噬菌 体广泛用于DNA重组技术中，近 年来在分支杆菌快速鉴定及药 物敏感性试验中得以广泛应用 。该方法的基本原理是分支杆 菌噬菌体只能感染相应的活的 分支杆菌，如待检标本中无相应 的分支杆菌，则噬菌体被随后 加入的杀毒剂全部杀死，故随 后加入的指示细胞因未受噬菌 体感染，因此能在培养皿中生 长繁殖，无噬菌斑出现;如待检 标本中含有相应的分支杆菌，则噬菌体侵入菌体内，免遭杀 毒剂破坏，并在菌体内大量增 殖，最终裂解菌体，释放出来 的噬菌体

13、即可感染指示细胞， 并使指示细胞裂解出现噬菌斑 。因此，根据噬菌斑的有无， 即可确定待检标本中是否含有 相应的活的分支杆菌。另外， 由于所用指示细胞生长繁殖速度 快，1824h即可观察结果，因 此本法具有快速诊断价值。国外报道，200-300cfu/ml MTB即可以该法检出，国内报道 1000cfu/mlMTB可被检出，因此 具有较高的灵敏度。特异性试 验结果表明，只有结核分支杆 菌复合群才出现阳性结果，而 常见NTM和常见呼吸道感染细菌 检测结果均为阴性。分组 样本数 阳性数(%) 涂阳培阳20 19(95) 涂阴培阳21 15(71) 涂阴培阴19 5(26)总之，本法快速、简便，又有 很高的特异性和较高的敏感性 ，不失为结核病快速诊断的有 效实验方法之一。尽管本法将有可能成为结核病 快速诊断的有效手段，但下列 因素应予注意，以免影响结果 。(1)每次实验必须设各种对照 ，以保证结果的可靠性;(2)加 入杀毒剂后一定要彻底摇匀， 以杀死全部噬菌体;(3)浇注平板 的琼脂温度不要太高，以免灭 活噬菌体；（）避免操作污 染。