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1、第六章 化学物质与蛋白质的相 互作用第一节第一节 化学物质对蛋白质的沉淀作用化学物质对蛋白质的沉淀作用一、沉淀作用的类型1可逆沉淀(非变性沉淀 )条件温和结构和性质不变化 分离和纯化蛋白质的基本方法具有部分纯化、浓缩特点等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法 一、沉淀作用的类型2不可逆沉淀（变性沉淀 ）强烈沉淀条件 破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性 破坏了蛋白质的结构和性质 加热沉淀 强酸碱沉淀 重金属盐沉淀 3抗体-抗原沉淀二、沉淀剂的类型1无机物沉淀（1）盐析 盐析方程 lgS=lgS0-KsISo代表当离子强度为零时的溶解度； S为蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度； I为中性盐的离子强度； Ks
2、为盐析常数，Ks值越大，该盐的盐析效果较好 阴离子对蛋白质盐析影响较显著，而阳离子影响次之。 含高价阴离子的盐，效果比1价的盐好 阴离子的盐析效果 高价阳离子的效果不如低价阳离子 对于1价阳离子： NH4+ K+ Na+最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠 枸橡酸盐 PO43- SO42-CHCOO-Cl-NO3-SCN-（2）金属离子沉淀法 Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+ 与蛋白质分子表面的羧基、氨基、咪唑基、胍基等侧链结合 Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+ 与蛋白质分子表面的羧基结合，但不与含氮化合物相结合 Ag2+、Hg2+与蛋白质分
3、子表面的巯基相结合 2等电点沉淀适用于疏水性较强 的蛋白质 优点：（1）很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常较 廉价；（2）某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所 允许；（3）常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。 缺点：酸化时易使蛋白质失活 3有机物沉淀主要效应是水活度的降低 （1）有机溶剂 优点：溶剂易蒸发除去，无残留 用途：适用于制备食品蛋白质 缺点：易使蛋白质变性失活， 且有机溶剂易燃、易爆，安全要求较高 最常用的溶剂是乙醇和丙酮 （2）酚类化合物及有机酸沉淀 鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2，4，6-三硝基苯酚）、 三氯乙酸、磺酰水杨酸 水解类单宁 缩合
4、类单宁 单宁-蛋白质结合是分子识别的典型例子。要考虑作为供体的多酚 和作为受体的蛋白质的分子组成、结构和构型，也要考虑它们的 协同作用。Haslam等认为，可用“手-手套”(Hand-in-Glove)模型说 明此反应。蛋白质分子中疏水基团较集中的部位构成“疏水袋”， 单宁分子进入“疏水袋”中并通过氢键加强结合。因此影响单宁与 蛋白质结合的因素有：单宁的分子尺寸，分子量大于500时产生较 牢固的结合；单宁的酚羟基和疏水基数量多者结合强；具有柔性 的分子构型者结合强；水溶性低者结合强。因此水解单宁的收敛 性与其所含疏水基多少有直接的关系，缩合单宁则与其聚合程度 有关，往往前者的收敛性大于后者。
5、4聚合物沉淀（1）非离子型聚合物沉淀法 （2）聚电解质沉淀法 羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶 聚丙烯酸 聚乙二醇（PEG） 第二节 化学物质对蛋白质的稳定作用蛋白质变性：某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态， 引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失的现象蛋白质不可逆失活的化学因素 强酸和强碱 氧化剂：分子氧、H2O2、过氧化物(如过氧甲酸)、氧自由基 去污剂和表面活性剂 ：十二烷基硫酸钠（SDS ）变性剂：810mol/L脲、 6 mol/L盐酸胍、有机溶剂 、EDTA重金属离子和巯基试剂：Hg2、Cd2、Pb2、巯基乙醇 使蛋白质稳定的化学方法（1）固定化（2）添加
6、剂（3）化学修饰共溶剂 抗氧化剂和还原剂底物、辅酶金属离子第三节第三节化学物质对蛋白质侧链基团化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用的共价修饰作用一、生物体内蛋白质加合物的形成相互作用方式 非共价结合共价结合不可逆 1 可与 蛋白 质发 生反 应的 化合 物2蛋白质分子中的可反应基团 氨基酸的氨基和羧基 丝氨酸和苏氨酸所特有的羟基 半胱氨酸的巯基 精氨酸的胍基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸中的酚基 色氨酸的吲哚基3与白蛋白的共价结合4与血红蛋白共价结合5与细胞内蛋白共价结合二、特定的氨基酸残基侧链基团的修饰蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反
7、应而实现的 作用：探测活性部位的结构 选择好的修饰试剂判断必需基团的性质和数目 1巯基的化学修饰烷基化试剂（碘乙酸、碘乙酰胺 ） 多肽链氨基酸顺序分析过程中防止半胱氨酸的氧化 N-乙基马来酰亚胺 有较强专一性和光吸收的变化，易于确定反应程度 5,5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） 有机汞试剂（对氯汞苯甲酸 ） 溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光 吸收具有较大的增强效应 2氨基的化学修饰非质子化赖氨酸的-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的 基团 三硝基苯磺酸（TNBS）与赖氨酸残基反应，在420nm和 367nm能够产生特定的光吸收 2,4-二硝基氟苯（DNFD）法、丹
8、磺酰氯（DNS）法和苯异硫 氰酸酯（PITC）法都是常用的氨基修饰方法。 3羧基的化学修饰水溶性的碳化二亚胺类化合物 4咪唑唑基的化学修饰饰组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。焦碳酸二乙酯（DPC）是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。 5酚和脂肪族羟羟基的化学修 饰饰四硝基甲烷（TNM）是酪氨酸残基修饰最常用的修饰试剂6胍基的化学修 饰饰丁二酮或1，2-环乙二酮与胍基反应可逆地生成精氨酸-丁二酮复合物 苯乙二醛可以与精氨酸残基不可逆的结合 4-羟基-3-硝基苯乙二醛可使被修饰的精氨酸残基在405nm处具有光吸收效应。 对硝基苯乙二醛修饰精氨酸残基可以得到具有旋光性
9、的惟一产物，在pH9.0的情况下可以用340nm处光吸收值来定量。三、亲和性标记亲和性标记试剂的优点： 能够选择性地结合在蛋白质分子的表面上的特定部位 具有饱和性，与底物或天然配体竞争蛋白质分子的结合位点。 两种类型 光亲和标记试剂 自杀性抑制剂第四节第四节蛋白质光谱探针蛋白质光谱探针紫外吸收或荧光光谱进行蛋白质的定量分析的理论基础： 蛋白质含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，在280nm附近有最大光吸收，并且在340350nm有荧光发射 。蛋白质光谱探针：就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白
10、质浓度或结构方面的信息。 一、蛋白质吸光探针1金属探针（1）双缩脲法 双缩脲在碱性溶液中与铜离子（Cu2+） 生成紫红色化合 物的反应，可在540 nm测量吸光度 紫红色（2）Folin-Lowry法 产物最大光吸收波长：640 nm优点：比双缩脲法灵敏100倍缺点：反应受多种因素干扰，在显色灵敏度方面存在差异。应用范围：本法可测定范围是25250g/mL蛋白质 （3）二喹啉甲酸法（BCA，bicinchoninic acid ） 原理：碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与铜离子反应生成Cu，Cu再与BCA反应形成紫色络合物，在565nm测量吸光度。 优点：试剂稳定，干扰少，各种蛋白质之间显色差异
11、小 2染料探针针原理：利用蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借助染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。600nm考马斯亮蓝G-250测蛋白质含量 595nm 优点：使用方便，反应时间短，染色稳定，对显色时间不严格要求，抗干扰性强，为常用的蛋白浓度测定方法。该法线性范围12 g/mL，是灵敏度最高的染料探针分析方法。二、蛋白质荧光探针作为一个好的荧光探针应满足以下条件：探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合比较牢固。探针的荧光必须对环境条件敏感。蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定及与金属离子结合的计
12、量化学等。常用的蛋白质荧光探针 1-苯氨基-8-萘磺酸（ANS） 与组合蛋白质在酸性条件下结合时能产生很强的荧光，激发峰位于375nm，荧光峰位于500nm，可用于组蛋白含量的测定 常用的蛋白质荧光探针-四（对磺苯基）卟啉（TPPS4） 微量蛋白质对TPPS4具有荧光猝灭作用，可以测定纳克级的蛋白质。 常用的蛋白质荧光探针2-对甲苯氨基萘-6-磺酸（TNS） 1-（N-二甲胺）萘-5-磺酸（DNS） 荧光胺 -四（对羧苯基）卟咻（TCPP） 铬天青S 吖啶橙 三、蛋白质光散射探针共振光散射技术 研究小分子物质与蛋白质、核酸等生物大分子 发生作用并形成聚集体的灵敏的探测技术 光散射探针分析的基础是试剂分子或络合物与蛋白 质结合，导致体系的光散射信号明显增强。 蛋白质光散射探针与蛋白质的吸收光谱探针相类似 三、蛋白质光散射探针共振光散射技术 优点：灵敏度较荧光分析法高， 可在普通荧光分光光度计上操作进行， 方便快速。 缺点：干扰因素多， 精密度和重现性差， 实际运用效果不佳。 ThanksThanks
