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1、 PCR检测系统分析性能验证上海市临床检验中心肖艳群1相关规定 医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域 的指南CNAS-GL xx 5.5.2) 实验室应在应用于医学检验之前验证所使用的检验方 法和程序的分析性能.对于定量检测项目内容至少包括 正确度、精密度、可报告(或线性)范围.对于定性检测 项目内容应包括灵敏度、特异性或符合率及重复性 上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法 临床基因扩增检验实验室在技术审核前应完成拟开展 检测项目方法学验证。方法学验证实验应包括但不限 于：精密度、正确度、检测限、线性范围、可报告范 围、特异性试验2什么情况下要做性能验证 开展新项目 更换检测系
2、统:更换仪器或试剂3分析性能验证项目 对配套系统,一般验证以下指标精密度准确度可报告范围参考区间 对非配套系统除验证上述指标外分析灵敏度分析特异性4依据文件(CLSI 文件) EP5-A2:定量测量方法的精密度性能评价 EP6-A:定量测量方法的线性评价 EP7-A:临床化学的干扰实验 EP9-A2:用患者样本进行方法学比对及偏倚评估 EP12-A2:定性实验方法评价用户协议 EP15-A2: 用户对精密度和准确度核实试验 EP17-A: 检出限和定量检出限确定方案 C28-A2: 医学实验室参考区间的定义和确定5性能验证前的准备 应熟悉待验证的检测系统 应熟悉验证方案的步骤(PCR检测项目成
3、本高、阳性标 本来源困难,精密度和正确度验证可以采用EP15-A2 文 件) 制定质量保证措施 确保足够的样本数量和覆盖较宽检测范围 确定比较方法6EP15-A2:精密度和准确度性能的用户验证 实验室验证方法的操作与厂家的申明一致 为验证重复性、实验室内精密度的申明提供方案和数 据分析 其他的 CLSI 文件为厂家做出精密度(EP5-A2)和准确 度(EP9-A2)的申明提供指南7精密度验证 重复性:指在相同条件 (时间、操作者、仪器)下获得 的精密度,也称批内精密度 实验室内精密度:同一实验室内，使用相同的设备, 在不同时间内获得的精密度,也称总精密度.(不包括大的 设备维护、仪器校准和更换
4、试剂批号等)8实验要求 试剂:同一批号 实验样本以前分析过的病人样本其他已知值的物质浓度要求:医学决定水平厂家说明书精密度指标所用浓度内容重复性实验室内精密度9实验步骤 根据厂家申明的精密度比例关系可分为3种情况:1)如果批内2/3 总:每天分析1批次,2个浓度,每个 浓度重复测定3次,连续3天.3)如果批内与 总相对关系未知:每天分析1批次,2个 浓度,每个浓度重复测定4次,连续5天. 每天做室内质控,如果失控,剔除数据,重新进行测定 实验数据的统计学处理:批内标准差、实验室内标准差10结果判断 重复性验证: 批内标准差厂家申明, 则通过计算验证值进行 差异的显著性检验,批内标准差厂家申 明
5、,则通过计算验证值进 行差异的显著性检验,实验室内标准差厂家指标(实验室指标),则通过计算验证值 进行差异的显著性检验, 在验证限范围内,验证通过16 选择厂家申明中使用的比较方法为本方案的比较方法 如两种方法在检测的浓度范围内标本结果差异不一致, 应参考EP9-A2文件(用病人标本进行方法学比对和偏倚 评估)来进行实验17使用参考物质的正确度方案 参考物质1)新鲜冰冻人血清或其他一些未掺入成分的人体物质: 已用参考方法或决定性方法定值2)从能力比对实验中获得的参考物3)厂家提供的正确度确认物或质控物4)实验室室间质评物被众多的实验室分析,他们的均值 可用于评估一致性5)由第三方提供的已用一些
6、不同方法定值的物质18实验步骤 至少2个物质,浓度为可报告范围中高和低的测量范围 在3-5天内每天测定一次,每次重复2次 将结果与设定要求进行比较,比如与能力比对实验组织 者的接受标准或医学允许总误差来比较19定量检出限的验证(EP17-A)20概念 能可靠检出分析物的最低实际浓度,并在该浓度下的总 误差符合准确度要求 总误差目标来源:实验室的需求、室间质评结果、厂家 的申明21实验样本 低浓度参考物质 已知浓度或活性的样品适当稀释成3-5个低浓度实验样品22实验步骤 至少25个重复测量 每个样品重复测量的结果与该样品的参考值比较,以确 定是否超出目标误差,超过误差目标的结果数量可用于 评价此
7、方法在该浓度是否合适.2320-1000个检测值符合超出LoB预期95%比例 的下限检测数 观察比例的下限(%)检测数 观察比例的下限(%）20 85 30 87 40 88 50 88 60 88 70 89 80 89 90 90100 90 150 91 200 92 250 92 300 92 400 93 500 93 1000 9424分析测量范围:概念 分析测量范围(线性范围):指患者样本未经任何处理( 稀释、浓缩或其他预处理),由检测系统直接测量得到 的可靠结果范围,在此范围内一系列不同样本分析物的 测量值与其实际浓度(真值)呈线性比例关系. 临床可报告范围:指定量检测项目向临
8、床能报告的检测 范围,患者样本可经稀释、浓缩或其他预处理. 线性:检测样本时,在一定范围内可以直接按比例关系 得出分析物含量的能力.25实验样品准备 选择与临床样本同样的基质,不含干扰物质; 或厂家推荐的产品 数量验证实验:5-7个不同浓度的样本,高值样本应高于 线性上限30%,低值样本低于线性下限,26实验方法 上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度,按试 剂说明书操作,将每一浓度样本重复检测2次,计算线性 相关系数27结果判断 线性范围应符合制造商规定的要求,且线性相 关系数|r|0.9728定性检测项目的性能验证29两种方法 诊断明确的定性检测性能评估:灵敏度、特异性 诊断不明确的定
9、性检测性能评估:结果的一致性, Kappa值表示30诊断明确的定性检测 比较方法:目前正在使用的、”金标准”方法、某种定 量方法或临床诊断 样本要求:量足够大,稳定 样本数量:取决于评价者的目的 结果不一样标本的处理:用金标准或参考方法明确结果31检测方法与明确诊断比较2*2列联表检测方法 明确诊断 阳性 阴性 总数阳性 A B A+B 阴性 C D C+D总数 A+C B+D A+B+C+D灵敏度灵敏度=100%=100%A/(A+C) A/(A+C) 特异性特异性=100%=100%B/(B+D)B/(B+D)阳性预测值阳性预测值=100%=100%A/(A+B)A/(A+B)阴性预测值阴
10、性预测值=100%=100%A/(A+C)A/(A+C)检验效能检验效能=100%(=100%(A+D)/NA+D)/N32诊断不明确的定性检测项目性能评估检测方法、可比较方法一致程度比较可比较方法 检测方法 阳性 阴性 总计阳性 a b a+b 阴性 c d c+d 总计 a+c b+d n一致程度百分比一致程度百分比= = 100%(a+d)/n100%(a+d)/nKappaKappa值值0.750.75，一致性优秀，一致性优秀 KappaKappa值：值：0.4-0.750.4-0.75，一致性较好，一致性较好 KappaKappa值值0.750.75，一致性差，一致性差33总体设计 首先完成精密度实验,精密度良好是其他方法学验证实 验的保障 准确度实验 分析测量范围、检出限34谢谢大家35
