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1、 实验六 细菌的生理生化试验Date一、 目的 1、 了解细菌鉴定中常用的生理生化试 验反应原理 。 2 、 掌握细菌生理生化试验的方法。Date二、原理由于细菌特有的单细胞原核生物的特性， 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。 不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物 质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不 相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系 统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的 今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定 中仍有很大作用。 Date三 、 材料1 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠 杆菌、沙门氏菌的斜面菌种 。2 培养基 葡萄糖发酵
2、培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖 蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、三糖铁琼 脂斜面等。Date3 试剂 5%的-萘酚溶液、 40KOH溶液、甲基 红试剂、吲哚试剂、乙醚。4 器具 超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试 管、移液管、接种环等。 Date四、 流程 糖类发酵试验 V-P试验M.R试验 吲哚试验 硫化氢试验三糖铁 （ TSI）琼脂试验 Date五、 步骤 (一) 糖类发酵试验 1 目的 了解不同细菌分解利用糖的能力及实 验原理，并掌握其操作方法。 Date2 原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出 是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸 ，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（
3、 即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH 在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的 颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基 中放入倒置杜氏小管观察是否产生气泡来判断 。 Date3 材料 3.2 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气 肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、沙门 氏菌的斜面菌种 3. 培养基 葡萄糖和乳糖发酵培养液试管 Date 流程 发酵液试管标记接种培养观察 记录 Date5 步骤 5.1 试管标记 取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养 液试管各 4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏 菌和空白对照。
4、Date5.2 接种 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空 白对照均不接菌。置37恒温箱中培养 ，分别在培养24h、48h、和72h观察结 果。 DateDateDate5.3 观察记录 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜 色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该 种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色， 反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸 ，记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内 有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并 产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气 泡为阴性反应，记录用“”表示。 Date(二)、乙酰甲基甲醇试验(VP试验) 1.目的 检测细菌
5、能否利用葡萄糖产生非酸性 或中性末端产物的能力。了解鉴别不同 肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原 理，并掌握其操作方法。Date2 原理葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 二乙酰 与胍基生成红色化合物某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分 解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙 酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧 氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成 红色化合物，称VP（+）反应。Date3 材料(1 )、菌种 大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、沙门氏菌的 斜面菌种 (2) 、培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基(3)、试剂V-P指试剂Date 流程培养液试管标记接种培养观察 记录 Date5 步骤 （1
6、 ）、 标记试管 取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试 管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 沙门氏菌和空白对照。 Date（2）、 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上 相应试管中，空白对照管不接菌，置 37恒温箱中，培养4872h。 Date（3 ）、观察记录取出以上试管，先加甲液（6%的-萘酚 溶液）0.5毫升,再加乙液（40KOH溶液） 0.5毫升,充分混匀,静置15min后，若培养液 呈红色者，记录为V.P.试验阳性反应（用“ ”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性 反应（用“”表示）。1小时后可出现假阳 性。 DateDate（三） 甲基红试验（M.R.试验）1、 目的 检测细
7、菌能否分解葡萄糖产生有机酸 的能力。了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲 基红试验原理，并掌握其操作方法。 Date2、 原理 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖， 在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一 步分解中，由于糖代谢的途径不同，可 产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量 酸性产物，可使培养基PH值下降至 pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 Date3 、材料 （1 ）、菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠 杆菌、沙门氏菌的斜面菌种 （2 ）、培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基Date4 流程 培养液试管标记接种培养 指示剂观察记录Date（1 ）、 标记试管 取4支装有葡萄糖蛋白胨培养
8、液的试 管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 沙门氏菌和空白对照。5 、 步骤 Date（2）、 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上 相应试管中，空白对照管不接菌，置 37恒温箱中，培养4872h。 Date（3 ）、观察记录取出以上试管，各加入56滴甲基 红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察 培养液上层，若培养液上层变成红色， 即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性 反应，分别用“”或“”表示。注意：甲基红指示剂不能加太多， 以免出现假阳性。Date甲基红（Methyl Red）试验结果Date阳性阴性对照Date（四）、靛基质（吲哚）试验 1 目的 用来检测细菌能否分解色氨酸产生吲 哚的能力
9、。掌握吲哚试验(Ehrlich法)的 原理和方法 。Date2 、原理 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋 白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲 哚本身没有颜色，不能直接看见，但当 加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试 剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。Date3、 材料 3.1 菌种 大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌3.2 培养基 蛋白胨水培养基 3.3 试剂 对二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 Date4 流程 标记试管接种培养观察记录 Date5 步骤 （1 ）、 标记试管 取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试 管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 沙门氏菌和空白对照。 Date（2）、 接种培养以无菌操
10、作分别接种少量菌苔至以 上相应试管中，空白对照管不接菌，置 37恒温箱中，培养4872h。 Date（3 ） 观察记录 在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡 使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于 培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴 吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以 防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在 ，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反 应，否则为阴性反应，阳性用“”、阴性用“ ”表示。Date6 结果Date(五)硫化氢试验某些能分解某些能分解胱氨酸胱氨酸H2SH2S与与醋酸铅醋酸铅或或硫酸亚铁硫酸亚铁 黑色（硫化铅或硫化铁）黑色（硫化铅或硫化铁）沙门氏菌沙门氏
11、菌DateDate（六）、三糖铁（TSI）琼脂试验原理本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或 产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡 萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少， 生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌 利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使 斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下， 酸类不被氧化，所以仍保持黄色。 Date3 材料(1 )、菌种 大肠埃希氏菌、产气肠杆菌杆菌、沙门氏菌的 斜面菌种 (2) 、培养基 三糖铁琼脂斜面培养基Date4 流程 标记试管接种培养观察记录 Date（1 ）、 标记试管 取4支三糖铁琼脂斜面培养基，分别 标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌
12、和空白对照。Date（2）、 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以 上相应试管先作划线分离培养，然后采 用穿刺培养方法刺到试管底，空白对照 管不接菌，置37恒温箱中，培养24 48h。 Date（3 ） 观察记录 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或 产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡 萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少， 生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌 利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使 斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下， 酸类不被氧化，所以仍保持黄色。 Date试验结果Date沙门氏菌的TSI试验DateDateDate实验项目 大肠杆菌 沙门氏菌 产气肠杆菌 葡萄糖 乳糖V-P试验 M.R试验 吲哚试验 醋酸铅 斜面 TSI试验 底层产气 硫化氢 实验结果Date思考题P220 12Date
