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1、生化中的定标和空白生化中的定标和空白n n定标的意义：定标的意义： 定标就是要找出一个参考点，就是一个定标就是要找出一个参考点，就是一个K K值（值（ 或或F F值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们测定值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们测定 一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪，一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪， 测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没有什么意测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没有什么意 义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性。那义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性。那 就要乘上一个就要乘上一
2、个K K值，计算并打印出来的结果对我们就有意义值，计算并打印出来的结果对我们就有意义 了。了。K K值就是我们通过定标找出来的。一般上最低要求是由值就是我们通过定标找出来的。一般上最低要求是由 试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个吸光度。试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个吸光度。 K=K=标准标准 浓度浓度/(A/(A标准标准A A试剂空白试剂空白) ) 标准液的浓度我们是知道的，这标准液的浓度我们是知道的，这 两个吸光度可以由仪器测出，这样就得出一个两个吸光度可以由仪器测出，这样就得出一个K K值。无论什值。无论什 么样的标本，用其吸光度乘以么样的标本，用其吸光度乘以K K值我们就得到了答
3、案。因此值我们就得到了答案。因此 ，K K值具有非常决定性的意义，可以决定标本的准确性。值具有非常决定性的意义，可以决定标本的准确性。 K K 值的决定因素：值的决定因素： 我们看看我们看看K K值会受到什么影响呢？值会受到什么影响呢？ 第一，第一， 标准液的浓度一定要准确（标准液最好与标本一样是以血清标准液的浓度一定要准确（标准液最好与标本一样是以血清 为基质的）。为基质的）。第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准 确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您的仪器相当稳定，试剂是影响的仪器相当
4、稳定，试剂是影响K K值的一个主要因素值的一个主要因素 。 如何确定如何确定K K值是正确的？值是正确的？ 一般我们用质控血清来一般我们用质控血清来 检查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结检查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结果很好，可以说果很好，可以说K K值是准确的，用这个值是准确的，用这个K K值计算出来值计算出来 病人的结果也是准确的，所以病人的结果也是准确的，所以K K值非常关键。值非常关键。 K K值的值的 真面目：真面目： K K值实际上代表了斜率，截距代表试剂空值实际上代表了斜率，截距代表试剂空 白，试剂空白每天都在变化，所以白，试剂空白每天都在变化，所以K K值的
5、稳定性决值的稳定性决 定您的仪器与试剂，如果仪器与试剂都十分稳定，定您的仪器与试剂，如果仪器与试剂都十分稳定，那那K K值也很稳定。值也很稳定。 多长时间定一次标合适？多长时间定一次标合适？ 这要看这要看 您试剂的稳定性，质控结果不好，有些项目做试剂您试剂的稳定性，质控结果不好，有些项目做试剂 空白可以解决，有些项目要做两点定标。空白可以解决，有些项目要做两点定标。 酶的项目酶的项目如何确定如何确定K K值：值： 一是计算出来的理论一是计算出来的理论K K值；值； K = (TV K = (TV 1000)/(SV L ) 1000)/(SV L ) 二是用有酶项目的定标液得出二是用有酶项目的
6、定标液得出 K K值：目前各公司可以提供多项目的定标液，不仅值：目前各公司可以提供多项目的定标液，不仅 有底物类的项目，也有酶类的项目。有底物类的项目，也有酶类的项目。生化检验中的各种空白概念生化检验中的各种空白概念n n1 1、试剂空白：、试剂空白： 由于生化测试测量的吸由于生化测试测量的吸 光度为相对吸光度，所以从理论上说，所光度为相对吸光度，所以从理论上说，所 有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光 度扣除。试剂本身的吸光度就是度扣除。试剂本身的吸光度就是 试剂空白试剂空白 。测量方法是按照正常测试的试剂和样本。测量方法是按照正常测试的试剂和样本 量量n
7、 n把样本换成蒸馏水来测量。把样本换成蒸馏水来测量。 在传统手工方法在传统手工方法 中中, ,每次测定都要做至少三个管每次测定都要做至少三个管: :测定管、标准管、测定管、标准管、 空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出来也空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出来也 就是试剂空白。因为就是试剂空白。因为 操作环境、仪器状态、试剂操作环境、仪器状态、试剂 稳定性等变异，所以要求每次都要测定试剂空白稳定性等变异，所以要求每次都要测定试剂空白 ，称为实时试剂空白。，称为实时试剂空白。 在全自动分析仪上，在全自动分析仪上， 大体上是模拟手工操作。但许多全自动分析仪为大体上是模拟手工操作。但许多全自动分
8、析仪为 追求速度，在设计上采用一些折中方法来测定试追求速度，在设计上采用一些折中方法来测定试 剂空白。以日立全系剂空白。以日立全系 列生化仪为例。该系列分析列生化仪为例。该系列分析 仪是做不了实时试剂空白，因为它们全是先加入仪是做不了实时试剂空白，因为它们全是先加入 样本后加试剂，为了折中，只好在定标时做一个样本后加试剂，为了折中，只好在定标时做一个 试剂空白，保试剂空白，保 存起来，需要扣除试剂空白时再减存起来，需要扣除试剂空白时再减 这个预先保存的值。这种做法，对于比较稳定的这个预先保存的值。这种做法，对于比较稳定的 试剂来讲，对结试剂来讲，对结n n果影响不大。果影响不大。 通俗的讲，日
9、立的仪器工作流通俗的讲，日立的仪器工作流 程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加入入R1R1试剂、试剂、R2R2试剂，所以试剂空白在每个测定项试剂，所以试剂空白在每个测定项 目曲线目曲线 中是无法看到的。但是中是无法看到的。但是76007600从从 CALIBRATIONCALIBRATION中是可以看到的，中是可以看到的，S1ABSS1ABS就是代表就是代表 试剂空白吸光度，在试剂空白吸光度，在CALIBRAT IONCALIBRAT ION画面里的下画面里的下 方找到方找到Reaction MonitorReaction Monitor（反应监
10、察），其中（反应监察），其中 STD(1)STD(1)就是代表试剂空白反应曲线就是代表试剂空白反应曲线. .为了减小误差为了减小误差 ，日立仪器会连续做两次测定，所以你看到，日立仪器会连续做两次测定，所以你看到 FIRSTFIRST和和SECONDSECOND两条，计算时是取他们的平均两条，计算时是取他们的平均 值。做试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳定值。做试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳定 ，积极采取措施纠正。对于日立，积极采取措施纠正。对于日立 的这种试剂空白的这种试剂空白 测定很多仪器都采用这种方法，也叫做试剂空白测定很多仪器都采用这种方法，也叫做试剂空白 校准。校准。 总的说来，自
11、动生化仪上的试剂空白总的说来，自动生化仪上的试剂空白 一般表现为零点吸光度，该吸光度是通过校准确一般表现为零点吸光度，该吸光度是通过校准确 立的。立的。n n2 2、样本空白：、样本空白： 由于溶血、脂血、黄疸等情况由于溶血、脂血、黄疸等情况 ，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响 。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白， 可以去除这可以去除这 方面的影响。测量方法是按照正常测方面的影响。测量方法是按照正常测 试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐 水来进行测
12、量。自动生化仪上，很难界定样本空水来进行测量。自动生化仪上，很难界定样本空 白。白。 与消除样本空白有关的大约有如下几点与消除样本空白有关的大约有如下几点: : a).a).在双试剂测定时，加入试剂在双试剂测定时，加入试剂1 1和样品后的吸光度和样品后的吸光度 可一定程度上扣除样本空白，所以有单可一定程度上扣除样本空白，所以有单 试剂不能试剂不能 扣除样本空白的说法。扣除样本空白的说法。 b).b).现在优质的试剂的抗现在优质的试剂的抗 干扰能力都比较强，比如有些双试剂，干扰能力都比较强，比如有些双试剂，R1R1加入后加入后 先和样本孵育一段时间，将血红蛋白、脂肪先和样本孵育一段时间，将血红蛋
13、白、脂肪n n胆红素等反应胆红素等反应 掉，再加入掉，再加入R2R2开始测定反应。在一开始测定反应。在一 定范围内都可以消除样本空白。定范围内都可以消除样本空白。 c).c).现代全自动现代全自动 生化仪大多采用双波长测定生化仪大多采用双波长测定. .双波长测定的原则是双波长测定的原则是 根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征，根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征， 选择两个波长和选择两个波长和 ，使干扰组分在这两个波长处的，使干扰组分在这两个波长处的 吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光 系数有显著差别。以两波长分别测定分析溶液的系数有显
14、著差别。以两波长分别测定分析溶液的吸光度，吸光度， 以两个吸光度值之差以两个吸光度值之差( (A)A)计算。这也可计算。这也可 以扣除一部分样本空白以扣除一部分样本空白. d) d).有些仪器有些仪器, ,例如日立例如日立 系列系列, ,有专门的有专门的“ “血清信息血清信息” ”功能的设置。做法都是功能的设置。做法都是 单单 独占用一个空白通道来计算，这也叫做样品空独占用一个空白通道来计算，这也叫做样品空白校准。白校准。 3 3、水空白：、水空白： 比色杯在加入水以后的比色杯在加入水以后的 吸光度。水空白的意义主要是对光路系统进行检吸光度。水空白的意义主要是对光路系统进行检 查和校正，如光源
15、，比色杯等，同时在计算中起查和校正，如光源，比色杯等，同时在计算中起到消除到消除“ “杯差杯差” ”的的 作用。日立作用。日立70607060中的中的Cell BlankCell Blank（ 杯空白）测定的就是水空白。杯空白）测定的就是水空白。 全面质量控制的内容全面质量控制的内容n n全面质量控制的内容主要包括分析前、分全面质量控制的内容主要包括分析前、分 析中、分析后这三个主要过程的质控。析中、分析后这三个主要过程的质控。n n只有认真的检测和控制这三个过程中各个只有认真的检测和控制这三个过程中各个 环节可能出现的误差，才能保证最后检测环节可能出现的误差，才能保证最后检测 结果的准确性，才能达到我们的质量要求结果的准确性，才能达到我们的质量要求 。（一）分析前质控（一）分析前质控n n人员培训人员培训n n实验室的设置实验室的设置 （水、电、相关设备、用具等）（水、电、相关设备、用具等）n n实验仪器的质量保证实验仪器的质量保证 ( (仪器的精度、波长的准确度仪器的精度、波长的准确度) )n n检测方法的选择和评价检测方法的选择和评价（重复实验、回收实验、干扰实验、方法比较实验）（重复实验、回收实验、干扰实验、方法比较实验）n n试剂和标准品的选择和评价试剂和标准品的选择和评价（线性范围测定、反应曲线的观察、稳定性实验）（线性范围测定、反应曲线的观察、稳定性实验
