《单链构象多态性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单链构象多态性分析（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、聚合酶链反应 单链构象多态性分析PCR-SSCP生物化工 刘静文随着分子生物学技术术的发发展，检测检测 基因结结构和突变变 的方法不断涌现现，尤其是PCR技术问术问 世以后，各种 与PCR相结结合的基因检测检测 技术进术进 一步推动动了基因研 究的发发展。如不对对称PCR产产物的直接测测序、核糖核 酸酶酶切法、限制性片段长长度多态态性分析等已成为为 基因分析的有力工具。这这些方法操作比较较繁琐琐，局 限性较较大，要求实验实验 条件高，不适合一般临临床实验实验 室使用。简介简介日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空 间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维
2、持的，当有一个碱 基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象， 使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分 子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离 开，该方法为单链构象多态性分析。 后将该方法用于检查PCR扩增产物的基因突变 ，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检 测突变方法的简便性和灵敏性。简介简介应用方向：检测检测 基因点突变变和短序列的缺失和插入检测检测 人类类引起遗传遗传 性疾病的研究基因的多态态性分析和DNA定量分析监测监测 PCR诊诊断实验实验 中的交叉污污染情况传传染源的调查调查将经扩
3、经扩 增的DNA片段经过经过 变变性处处理，形 成单链单链 ，由于序列不同，单链单链 构象就 有差异，在中性聚丙烯酰烯酰 胺凝胶中电电泳 的迁移率不同，通过过与标标准物的对对比， 即可检测检测 出有无变变异。原理刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产 物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降 低了成本，具有经济、快速、灵敏等特 点。1993年起用EB染色法显示DNA带型 ，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速。流程示意注意事项1.用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性 越高。300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适 于SSCP 分析。 2.游离引物可能
4、同 PCR产物结合而改变其泳动率。 3.凝胶中加入低浓度的变性剂，如5-10甘油、5 尿素或甲酸胺、10二甲亚砜或蔗糖等，有助于提高敏感性。 4.保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素。 5.凝胶浓度很重要，一般使用58的凝胶。凝胶中的甘油 对聚合酶链反应-单链构象多态性技术的影响方法：取5 l PCR产物与等量加样缓冲液混匀，95变 性3分钟后立即置冰上，取34 l相同的样本在A、B二 种条件下进行。A条件下凝胶中含5%甘油，B条件下凝 胶中不含甘油，其他条件均为：9%非变性聚丙烯酰胺 凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=491)，0.5TBE作 电泳缓冲液，恒流10 mA，同一室温下电泳
5、6小时。温度 对聚合酶链反应-单链构象多态性技术的影响单链DNA的构象受温度的影响很大，操作 温度是SSCP的关键参数之一。常规的平板凝胶电泳在低温(如4)或室温下进行，毛 细管SSCP并不需要像平板电泳那么低的温 度(如4)操作，1418就足够了。Andersen等对对14个不同的等位基因的突 变变体分别别用平板胶在5 、20 下，毛 细细管电电泳在18、25、35下检测检测 ， 结结果表明，5的平板胶电电泳和18的毛 细细管电电泳可检测检测 出所有突变变，而2O的 平板胶电电泳只能检检出9个突变变，25和 35的毛细细管电电泳分别别只能检检出11个和8 个突变变。不同的样样品、不同的缓缓冲
6、溶液以及不同的聚 合物成分都会有不同的最适温度。使用多个 操作温度，灵敏度就会提高。单单一温度下检检 测测率在67%100%的多个突变变，若在多个温 度的结结合下检测检测 ，检检出率都可达100%。另外 还还可采用温度梯度电电泳。在低黏度3%羟羟乙基 纤维纤维 素中，进进行温度梯度电电泳，突变检测变检测 的灵敏度可达100%。又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP，方法是：先用重 亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引 物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰 胺凝胶电泳，由于DNA电泳时的移动性取决于其二级 结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决 定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰 胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分 离开，随后进行单链构象多态性分析加以明确。甲基化敏感性单链构象分析 （MS-SSCA）1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析 ； 2.能够对甲基化的等位基因进行半定量；3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性。 1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开 ，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的 CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤 、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低； 2.检测片段不宜过长。优点缺点谢谢观看 ！
