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1、Western-blot 试验技术诺贝尔出品 http:/概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异 敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方 法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变 性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋 白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克 隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以 对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具 有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优 点。 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医 学的研究。溶解蛋白策略 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但 这可能导致免疫反应性的丢失。 2 采用温和
2、的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这 造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细 胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵 抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来 调整提取的条件。 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血 清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白 的多种形式起反应。溶解方法 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质 ： 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓 冲液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然 后制备提取液。 3 哺乳动物组织通常可以
3、机械分散并直接溶于 SDS凝胶加样缓冲液。 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶 抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓 冲液裂解。细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得 很粘稠。吸入1.5ml离心管。 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层 为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上 清转入另一Eppendorf -80C保存注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡 沫。 检测
4、蛋白的敏感性15ng,0.75mm厚的SDS PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即 可被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。主要试剂RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Wes
5、tern Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）仪器与设备 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）配制试剂10电泳Buffer称取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去离子水，定容至1000mlSDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调P
6、H至8.8，定容 100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml 转膜缓冲液称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。配制试剂 30Acry-Bis29克丙烯酰胺1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4保存 10过硫酸胺，新鲜配制，= 滤纸 胶, 就行，你转移前和转移过程中看看电压 就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时
7、一般是开始的1.5-3 倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。 疑难杂证 电泳时Marker 按说明加5ul，但电泳中看不见，是失活 了吗？ 加入20ul即可。 蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了 ，为什么了？ 可能是1样品浓度过低2转移时间不够。 一抗量较少，同时不知道一抗的最佳稀释比例是多少， 怎么做呢？ 确定实验过程无污染后，将含抗体的稀释液回收，保存 于-70。最好第一次的 浓度做高一点，这样，如果结果不好，可以尝试再稀释 。免疫沉淀法检测表达蛋白 可用于检测并定量分析多种蛋白质复合物 中的靶抗原。 很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋 白。 当
8、与SDS-PAGE并用时，即可用于分析外源 基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况 。操作步骤 靶蛋白的放射性标记 裂解细胞 特异性免疫复合物的形成 免疫复合物的收集和纯化 放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析靶蛋白的放射性标记 同位素通常是35S，其半衰期为87.1天，同位素 是以35S标记蛋氨酸或35S蛋氨酸和半胱氨酸 。 这些氨基酸是哺乳动物细胞的必须氨基酸，必 须由培养基中提供。 培养基中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为 了增加同位素标记氨基酸的渗入率，可去除培 养基中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸 。 同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度 和其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度 。免疫复合物的收集和纯化 用耦联葡萄球菌蛋白A和Sepharose进行吸附： 结果清晰，但成本高，并且所需抗体有种系特 异性的限制。 用经热致死并经甲醛固定的S.aureus细胞进行 吸附：背景高，但是经济。 用抗被检蛋白抗体的抗体进行吸附，这种方法 用于下列两种情况：1第一抗体的FC不能被葡萄 球菌蛋白质A识别；2对被检蛋白进行定量分析 时。
