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1、临床微生物实验室必须进行规范化革命卫生部北京医院 张秀珍 人类面临着微生物的挑战, 要打赢这场战争 不仅需要有经验的医生,还需要一支优秀的 侦察队伍临床微生物检验队伍。临床细 菌室规模和发展速度与10年或20年前相比 已经发生了巨大的变化,但离CLSI(临床实验 室标准化研究所)标准化文件要求还相差很 远,基层细菌室必须进行规范操作革命才可 能应对微生物向人类的挑战,才能适应临床 的需要.卫生部医政司 2004年制定中国第一版抗菌药物合理应用指南.国务院副 总理吴仪也做出了重要批示 05年卫生部提出星火培训项目:包括临床医生和细菌实验 室 06年，耐药菌监测网正式成立包括128家医院。 马晓伟
2、提出了“药师管理，合理用药”的指导思想。 目前，基层用药尤其是抗生素情况不很乐观。社区医院情 况也十分让人担忧。三级医院规模虽然大，但是数量太少 。不能满足绝大多数看病者的需求。 07年完成了培训教材由人民卫生出版社出版, 08年10月启动培训,在北京.您可能每天面临以下问题的挑战 同时做需氧血培养和厌氧血培养时血液先注入需 氧瓶或厌氧瓶？ 脓标本有时涂片见到细菌为什么培养阴性？ 非上班时间需要做厌氧培养怎么办？ 明显细菌性脑膜炎为什么培养阴性？ 痰标本分离出4种细菌做哪一种细菌的药敏试验？ 数量很多的凝固酶阴性葡萄球菌在痰里分离出来 是否要做药敏?参考CLSI M2 M7 M42 M47从以
3、下 7方面提出建议 标本采集和运送的规范； 培养前标本质量检测规范； 标本接种规范； 细菌鉴定基本流程规范； 细菌药物敏感试验规范； 实验室质量控制； 无菌体液细菌报告规范； 标本采集和运送 标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关 键 但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人 自己完成,所以也是最不容易做好的事情，而且不 知道问题所在之处,造成的后果是: 临床医生最不能接受的问题:阳性率低棉 花 纤 维 + 竹 / 木 条 抑 菌 区 是 因 为 ： 植 物 分 泌 出 来 的 ： 脂 肪 酸 ； 树 脂 ； 福 尔 马 林氯 气 ， 重 金 属 与 胶 水 的 影 响 美 国 与 欧
4、洲 对 实 验 室 的 新 要 求NCCLS M40 NCCLS M40 标标 准准 DIN 58942 DIN 58942 标标 准准 COPAN COPAN AmiesAmies 运运 送送 培培 养养 基基 多用途运送系统 需氧 + 厌氧低 氧 化 的 环 境 不会 对标本的微生物造成损害拭 子 是 深 入 培 养 基 中 来 保 护 苛 养 菌 与 厌 氧 菌 两面是以塑料密封两面是以塑料密封, ,不透水和不透水和 漏气漏气 减少污染和维持缺氧减少污染和维持缺氧 环境环境ASM 2004流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率泌尿标本采集的规范 1采集后的标本应立即送检。 2采集时间：多
5、数药物从尿道排泄，所以 不管用哪种方法都应在用药前采集。应采 集早晨第一次的尿。 3 标本管不应含防腐剂和消毒剂。 泌尿标本采集的规范 1.采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴 和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清 水冲洗。 2.长期留置导尿管的患者应在更换新管时留 取尿标本。 3. 做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。分泌物采集规范 1. 对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、 扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、 瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶 。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧 的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物， 也可取感染部位下的组织送检。 2. 闭锁性脓
6、肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、 腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿 刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注 意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可 能。不能及时送检应应用输送培养基。便标本采集规范 1.采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集 ；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现 症状即采集。 2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血 和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物 盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接 盛于增菌液或保存液中；对不易获得粪便患者及 幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养 基中送检。便标本采集规范 3. 注意事项： 虽然粪便
7、标本本身含很多细菌但也要用 无菌容器。 在患者病情许可的条件下应在用药前采 集标本。 应床边接种或置输送培养基送检。 厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽 量减少与空气接触。痰标本的采集和运送 1. 标本采集时间：用抗生素前 2. 采集方法： 自然咳痰：必须用请水漱口3次，应包括咽 喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器中或 输送培养基中。 支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议 直接种入输送培养基厌培养标本采集规范 1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管 穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不 能用于厌氧培养。 2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱 穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养3便标本厌氧培养
8、标本采集： 可用排出的 便做厌氧培养但也应少与空气接触。CLSI血培养的原则和操作程序推荐（Proposed）指南 2006年10月出版：M47-P 只是协商后的推荐稿（consensus proposed） 收集来自全球的评论和建议 收集截止日期：2007年1月29日 下一步要出版投票通过的试行指南英国HPA 的血培养的研究及操作程序2005-09-08出版：BSOP 37 Issue 5http:/www.hpa-standards.org.uk/pdf_sops.aspINVESTIGATION OF BLOOD CULTURES (FOR ORGANISMS OTHER THAN MY
9、COBACTERIUM SPESIES) 参编单位： 医学微生物协会, 临床微生物协会 苏格兰微生物协会, IBMS, Welsh微生物协会 统一由卫生防护署 （Health Protection Agency）领导优质的实验室操作 取血合适的时间 尽可能抗菌药使用前 寒颤和发热初起；心内膜炎（持续性菌血症）例外 标本类型和取血方法 不要和测血气及血沉的取血同时进行（或在先 ） 穿刺点消毒： 以醇类、洗必泰为好血标本的收集优质的实验室操作1. 从静脉取血 2. 不宜从静脉导管或静脉留置口取血 3. 若导管设施取血*，必需同时静脉取血，以求对比 和解释不要弃去初段血，不用抗凝剂冲洗4.不推荐静脉
10、血直接入瓶 5.不主张换针头入瓶 6.有血的培养瓶不可放入冰箱和冻箱保存建议第一天 1-3套血，每套16-20ml第二天 ,如无迹象有细菌生长 1-2套，每套16-20ml瓶数及血量结论1： 绝对不能只用一瓶 寒战升温之间应采血20毫升分装两个瓶内 先分配在需氧瓶10ml，然后剩余的入厌氧瓶内，因为真菌、绿脓 杆菌、窄食单胞菌只长在需氧瓶内。 结论2：2-5天内不必重复取血结论3：只有可疑为持续性菌血症：如心内膜炎、导管相关sepsis时 ，才要有间隔地(1h至24h)几次取血监测、捕捉、指导治疗；特别是 金葡菌时。血液及骨髓标本采集运送的规范 1. 采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎 例
11、外。 2. 采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应 采一套 2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16 -20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血 注入厌氧瓶。 3. 采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血 ；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入 瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。抽血量和体重的关系 体重 Kg抽血量 ml套（需氧+厌氧 ） =36.340-602-3血液及骨髓标本采集运送的规范 4. 采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养 标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎 和导管相关性败血症。 5. 儿童：采血量是总血量的1%。 6. 延迟培养瓶处理: 延迟培养瓶不
12、要放冰箱或孵 箱,放常温，尽早送往临床细菌室。 7. 皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去 脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。其他无菌体液的采集运送规范 1 无菌采集是培养成功的首要因素 2 采集的标本应立即送至临床细菌室，脑 膜炎球菌有自溶酶，离体后回迅速自溶。 肺炎链球菌和流感嗜血杆菌离体后极易死 亡。 3延迟送检时一定不能放冰箱，肺炎链球 菌和流感嗜血杆菌等对温度敏感的细菌在 冰箱会很快死亡。参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下 7方面提出建议 标本采集和运送的规范； 培养前标本质量检测规范； 标本接种规范； 细菌鉴定基本流程规范； 细菌药物敏感试验规范； 实验室质量控制；
13、无菌体液细菌报告规范； 痰培养标本培养前规范 实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色， 当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上 皮细胞大于25个每视野时应作为不宜做培 养的标本； 当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于 25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌 分布作出判断： 痰培养标本培养前规范 当标本中细菌种类超过3种以上，未见到钎 毛拄状上皮细胞，作为不合格标本；如见 到数量不等的白血胞或钎毛拄状上皮细胞 或两者同在，含1-2种不同细菌，可考虑继 续培养，结果可根据病情再作分析；当涂 片中见到1-3种细菌，少量的扁平上皮细胞 ，少量或较多钎毛拄状上皮细胞均可按合 格标本继续培养。厌氧培养 在正
14、常上班时间： 申请厌氧培养的科室应邀请实验室，由临床医生 或护士采集，细菌室行床边接种。 自然排出的尿标本、用棉拭子采集的分泌物、自 然咳出的痰标本均为不合格的厌氧培养的标本， 应于退检。 没有条件或不能及时送检的情况下均应用输送培 养基放置标本 。培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌 尿培养分离出3种以上的细菌，或分离出 凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌 等非定义为致病菌的细菌，涂片未见到， 应在报告中提示可能是污染细菌建议结合 临床表现考虑结果的参考价值。 眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌 ，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议 重送标本。培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌 前列腺液标本
15、分离出凝固酶阴性葡萄球 菌或革兰阳性小杆菌，涂片未见到，可能 是污染细菌，应建议重送标本。 当涂片中见到的细菌，并有细菌吞嗜现 象存在，在培养时分离出该细菌可推测为 致病菌。培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌 (5)涂片报告的日期和培养报告日期要对应 便于医生判别结果的参考价值. （6）并每一视野可见到20个/油镜或该菌 占所见到细菌的50%,可推测是标本中的优 势细菌.参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下 7方面提出建议 标本采集和运送的规范； 培养前标本质量检测规范； 标本接种规范； 细菌鉴定基本流程规范； 细菌药物敏感试验规范； 实验室质量控制； 无菌体液细菌报告规范； 有了合格的标本是保证培养成功的重要条 件，但如果没有适宜的分离培养基和培养 环境同样不能获得好的结果，为此制定如 下基本条例以保证致病细菌分离成功。分离培养规范痰培养 1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、 中国兰琼脂或伊红美兰、或加MRSA显色琼脂。 2培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂 、置5-7%CO2、35环境培养，其他培养基置 35空气培养。 3结核培养：罗氏鸡蛋斜面，每一标
