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1、第六讲 RNA 遗传一、RNA世界-生命早期的遗传物质二、RNA 干涉现象三、RNAi 对基因表达的作用四、RNA 编辑RNAi 的分子机制；si RNA的产生与扩增RNAi 的遗传五、RNA编辑的特点与意义RNAi 是对基因组的基因表达的反馈RNAi 引导的同源 RNA 降解RNAi 引导的同源 DNA 修饰1. RNA世界- 生命早期的遗传物质nRNA世界假说认为在生命进化早期没有蛋白质酶，某些 RNA序列可以催化RNA的复制。也就是说，RNA是生命早 期的唯一遗传物质，它是生命的源头。在RNA遗传的基础 上，才有了后来的DNA与蛋白质体系。事实上，RNA的 遗传作用并未在生命的进化中消失
2、，在一定程度上，RNA 仍在支配着DNA与蛋白质的命运。nJohnston WK等的工作证明某种RNA分子确实能够催化RNA复制 中的多聚化。它使用NTP及RNA模板的编码信息使RNA引物（ RNA primer）持续增加14个核苷酸的长度，等于RNA螺旋的一圈 。这种多聚化是RNA模板依赖的，是按照引物的序列、长度，以 及RNA模板的信息进行的，证明了引物的3是在与RNA模板逐一 地、严格地配对的情况下进行的。结果，多聚化过程是逼真的； 在引物被扩展11个核苷酸的情况下，对此等序列进行了克隆和序 列分析，在1100个样品中有1088个是与模板准确匹配的。nBartel等使用存在于随机RNA序
3、列的备用池 中的RNA-连接酶ribozyme衍生物。某些衍 生物能够使用NTP及RNA模板的部分区域 进行模板指导的引物延伸。这些连接酶衍 生物通过与模板的不配对的一特异小段的 杂交来识别并催化该引物-模板复合体的 RNA复制。从使用特异模板的一小段来指 导引物延伸来看，这些ribozymes不像复制 RNA/DNA的酶的多聚化反应更类似于末端 酶。RNA引物通过适当 的模板使得引物链 在ribozyme的指导 下进行引物的延伸Ribozyme的3区必 须与模板的5区配 对，才能起到催化 的作用。n从上述可知，W.K.Johnston等所描述的RNA 复制虽然效率不高，却是真正的RNA自我
4、复制，因为它不像DNA复制那样，需要许 多蛋白质酶来进行加工。而这里的RNA复 制，这不需要任何的蛋白质，完全由RNA 酶及RNA模板完成。而通常的DNA/RNA病 毒的复制（繁殖）以及细胞的DNA复制都 不是由纯粹的DNA或RNA系统完成的。因 此，RNA无疑地是一种分子模板。n就在修正后的最新版本的中心法则中，我 们看到RNA已不是过去的中间环节，而是 具有与DNA同等地位的遗传模板。2、RNA干涉现象n2.1 RNAi的分子机制nRNA对基因表达的调控称为RNA干涉。nRNAi是一种转录后的基因沉默现象，是dsRNA触发细胞质 中与其同源的mRNA的降解，或在细胞核中dsRNA诱导同 源
5、的DNA的后生修饰（甲基化）而导致转录水平上的沉默 。RNA沉默是一种阻遏外来序列的有效手段，并在植物及 动物发育中有重要作用。n关于RNAi作用机制大概如下：在不同的生物中，不同来 源的双链RNA被DICER（含有螺旋酶，dsRNA结合域，及 PAZ域）裂解为一种具有特异序列的活性中间体-21-23 核苷酸长的双链的siRNA。然后，siRNA结合核酸酶复合 物（RISC的蛋白质部分）形成所谓RNA诱导沉默复合物（ RISC）。激活的RISC依靠siRNA中的一条链去寻找互补的 mRNA链，然后RISC中的核酸内切酶Argonaute2在距离 siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA，从而
6、将mRNA降解 。同时siRNAs作用于核中的DNA同源序列，产生RNA- DNA双链和单链凸起，吸引DNA重新甲基化转移酶，导 致DNA的甲基化。2.2 siRNA的产生与扩增n在线虫中，小量的dsRNA能够作用于大量的靶 mRNA。这是因为dsRNA在转变为siRNA的过程中 ，至少有三种扩增的途径。1、Dicer酶（含有螺旋 酶，dsRNA结合域，及PAZ域）可以把长的 dsRNA截成1020段，等于扩增1020倍。2、存 在一种催化机制，siRNA常常成倍地增加，以用 于进一步的扩增。3、短的RNAs能作为靶mRNA 的引物，在RNA依赖的RNA多聚酶的作用下，启 动一个RNA指导的R
7、NA多聚化反应，随后产生许 多“次级siRNAs”，称之为靶指导的扩增。n首先dsRNA被切成短的siRNA，使dsRNA转换成ssRNA。 这些单链的siRNA（与蛋白质结合）如果没有识别同源的 靶mRNA，并与之配对，就会被降解掉。一旦反义的 siRNA与靶mRNA配对，则靶指导的siRNA的扩增就会发生 。这时，与靶mRNA配对的siRNA小段将沿mRNA延伸（ 双向的或单向的），但只能延伸几百个碱基左右就停止， 并从该区裂解下来而成为次级siRNA。这种效应称为“可迁 移效应”。于是，siRNA与靶mRNA的稳定化与“可迁移效 应”的结合就形成了一个链式反应，在这个反应中，随着 Dic
8、er的作用、siRNA引物的更新，以及新的一轮的扩增， 将发生siRNA的多轮的复制。n应该注意到，这种复制或扩增，并不是自我复制/扩增， 而是从primerA产生primerB, primerC, primerD等，这是一个 从局部延伸为全体，再从全体裂解为若干局部的过程。2.3 RNAi的遗传n注射dsRNA到线虫两性体，在子一代产生的基因沉默往往 在F2代消失。但如果RNAi在母体启动，它可以通过F1代 的精子传到F2代，尽管该精子缺乏RNAi的靶基因。所以 ，RNAi一旦启动，雄性生殖系细胞能够传递RNAi, 即使在 缺乏内源靶基因的情况下。因此RNAi性状是后生的，可 遗传的。它并不
9、需要通过基因序列的改变 突变。已成熟的卵不受RNAi的影响。未成熟的卵是RNAi的携带者，在F1代的双性体 中，所产生的卵是死卵。RNAi可以通过雄性传递下去，因为F1代的精子缺乏 RNAi的靶基因。当雄性体与未注射dsRNA的双性体杂交，可产生F2代。但F2代 的双性体产生的卵为死卵。表明RNAi是可以遗传的产生F1代雄性，它携带pos-1（RNAi）及染色体pos-1座位缺失（mDf3), 该F1为杂合体，其另一等位基因为野生型（+）。当它与不协调表型的 纯合体杂交时，产生左图的mDf3的F2代，经自交产生的卵2/3具有pos- 1表型；右图表示野生型F2代，仍有1/9的卵具有pos-1表
10、型。说明RNAi 遗传在母性建立，在父性传递ndsRNA先被转换成特异序列中间体，然后引起同源的mRNA降解。rde -1和rde-4为从dsRNA产生R所需要。而响应R使靶mRNA降解则需要rde -2和mut-7。如果rde-2和mut-7突变，R无法响应mRNA的沉默，也就是 无法导致mRNA的沉默降解，但却能使内元转位子的转位激活，说明 RNAi过程是造成转位子抑制的原因。如果rde-1和rde-4发生突变，则 对线虫注射dsRNA后，也不能引起基因沉默，在生殖细胞中也不能引 起转位子的激活。nGrishok已经能分离出启动可遗传的RNAi状态（在母性） 的组织，在F2代内该组织的靶m
11、RNA是被降解的。这就有 机会检验如果四个基因（rde-1, rde-4, mut-7, rde-2) 的突变 不产生RNAi响应，是否也不能启动可遗传的RNAi。结果 发现，rde-1和rde-4突变体能够遗传RNAi,即能够遗传RNAi 介导的特异基因沉默，即使它们本身对注射的dsRNA不能 产生响应。相比之下，mut-7和rde-2的基因产物对于在F2 代产生遗传的RNAi是必不可少的，说明它们对于启动或 遗传基因沉默都是重要的。n总之，从线虫RNAi遗传的母性建立与父性传递的事实， 以及发现基因mut-7和rde-2对RNAi遗传的必不可少性，说 明RNAi现象是遗传的，是一种遗传效应
12、。这种小RNA分 子是一种后成的RNA遗传。3. RNAi对基因表达的作用nRNAi的发现使我们对于RNA调控基因大开眼界。这种小 的RNAs分子根据它们的来源不同被称为siRNAs或miRNAs 。它们借助与互补的mRNA的结合，触发mRNA降解或阻 止mRNA翻译成蛋白质。n近来，知道RNAi途径不仅限于作用于基因组或使mRNA沉 默；在裂殖酵母（ S.pombe）中RNAi是装配着丝粒和使配 对型区异染色质化所必需的。常染色质可因RNAi的作用 而形成异染色质。另外，在有性周期中，分散的内源DNA 重复序列可用同样的沉默机制来抑制基因表达。n用人工合成的发夹RNA（shRNA）构建成质粒
13、载体，转入真核细胞生 物体中，可以诱导与发夹RNA序列一致的内源靶基因沉默。如一种编 码在质粒上的ura4+ shRNA能够使真菌的ura4+标记基因沉默，并使异 染色质形成。这种基因沉默依赖于RNAi机构：由Dicer、Ago1和Rdp1 等构成。该机构可以解释传统的RNAi沉默，但无法解释沉默总是伴随 着异染色质的形成。n研究发现，使组蛋白甲基化得Clr4酶对于ura4+沉默及ura4+ siRNA的产 生是必需的。同时，染色质免疫沉淀实验表明，对于ura4+位点的修 饰模式与对于着丝粒重复序列的模式及配对区的模式是一致的；因此 ，在ura4+靶位的RNAi沉默是总与染色质的修饰伴随发生。
14、另外，真 菌的异染色质蛋白1，swi6对于从ura4+位点扩展异染色质是必需的。 Swi6也是形成异染色质的另一成分 cohesin所需要。n因此，异染色质的所有特性都是建立在ura4+位点的RNAi的沉默机制 上。Ura4+的实验表明，RNAi能使一个正常表达的基因沉默，并从该 基因的侧面启动异染色质的形成。n但是，该项实验室以质粒上所编码的shRNA进行的。在自然状态下， 该过程是怎样进行的？转位子可能是导致内源基因沉默的内在因素。 在基因组中分散的DNA重复序列，它们中的许多来自转位子，可能为 邻近的宿主基因提供调控的序列，从而对发育中的基因表达起调节作 用。n虽然真菌S.pombe的基
15、因组并不像动植物的基因组那样充满了转位子 ，但它仍然含有13个长末端重复序列（LTR）逆转录转位子和250个分 散的单独的LTRs。对11个在减数分裂时被调控的基因的研究发现，在 它们的附近都有LTRs。在不同的RNAi因子（dcr1,ago1, rdp1）及染色 质因子（clr4, swi6）的突变体的情况下，检验了这些减数分裂诱导的 基因的表达。在此等突变体中，发现这些基因的启动子如果位于LTR 的7kb之内就不被抑制，而那些位于10kb之外则处于沉默状态。另外 ，用ura4+基因来代替LRT，就导致邻近基因的组成性表达，这就提供 了LTRs是基因抑制所必需的直接证据，而异染色质的形成是基
16、因表达 抑制的一种方式，说明LTRs是RNAi/swi6依赖的异染色质形成的靶位 。因此，RNAi的机制促进了转位子的LTRs对细胞分化的调控，及启 动异染色质向邻近基因的扩展。n真菌S.pombe的基因组简单，它的RNAi蛋白及染色质因子各自只由一 个基因来编码，便于开展RNAi依赖的染色质修饰作用在调控S.pombe 的正常基因表达的研究。n但在高等生物中，RNAi及染色质因子的数量及种类要复杂得多。现在 的问题是S.pombe中的RNAi依赖的染色质沉默过程如何在动植物中进 行。有待解决的是蛋白质怎样响应RNA信号。是小RNAs分子直接地 吸收染色质因子，还是RNAs因子把染色质因子激活后而通过其他途 径吸收？n可能的答案是在植物中观察到的RNA指导的DNA甲基化。与S.pombe 中Swi6依赖的RNAi诱导的异染色质化相对应的是，RNA指导的DNA 甲基化主要地被限制在RNA-DNA序列同一性的区域。而DNA甲基转 移酶负责DNA的甲基化，它暗示DNA甲基转移酶是把一种RNA-DNA 杂交体作为识别的基质，并由此去结
