12第三章半薄与超薄切片

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1、第三章 超薄切片与半薄切片第一节 超薄切片专用于透射电子显微镜标本的制备透射电镜 透射电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段：我们所获得的关于细胞、细 胞器、细胞内大分子的形态信息大多由它提供 透射电镜的样品制备中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。高尔基体Chloroplast of tobacco: 1 = cell wall 2 = cytoplasm 3 = vacuole 4 = chloroplast envelope 叶绿体被膜 5 = tonoplast液泡膜 6 = plasma membrane质膜 7 = grana叶绿体基粒 8 = stroma thylakoid

2、s类囊体 9 = starch grains淀粉粒 10 = stroma基质 叶绿体内质网线粒体酶体超薄切片植物细胞的大小 直径多为25-50um之间。最小：球菌直径0.5um。 最大：苎麻纤维细胞长550mm。 超薄切片厚度是50-70nm1细胞=350-1000张切片 透射电镜样品制备中，由于透射电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须 把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片 。 切片厚度:50-70nm 制作程序与石蜡切片相似,只是包埋剂不同(环氧树脂),切片方法不同超薄切片制作程序一. 取材的基本要求为保持细胞结构的生前状态, 必须做到快、小、准、冷(1)快:最

3、短时间内(争取在1min内)投入固定液。 (2)小:体积要小(一般不超过1mm1mm1mm)。固定剂的渗透能力较弱；如果块大，内部不能得到良好的固定。 (3)准:取材部位要准确。 (4)冷:低温(04)操作,以降低酶的活性,防止细胞自溶。与石蜡切片相似, 经取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切 片及染色等步骤。二.固定1. 固定剂四氧化锇: 对多细胞结构蛋白, 脂肪, 脂蛋白的固定效果好。有强烈的电子染色 作用, 固定样品图象反差较好。戊 二 醛: 穿透力比四氧化锇强. 糖原、微管、核蛋白的固定效果比锇酸好. 对 脂类的保存能力很差, 没有电子染色作用。电子染色原理某些重金属盐（铀、铅等）与组

4、织细胞中某些成分结合或被组织吸附, 重 金属的原子对电子束形成散射, 从而提高图象的反差。拟南介小孢子母细胞二.固定2. 固定方法: 戊二醛锇酸双重固定法- 分预固定和后固定,中间用磷酸缓冲液漂洗.- 这样可以相互补充,使细胞的细微结构得到很好的保存。 步骤: 前固定用2.5%戊二醛固定2小时、后固定用1%锇酸固定1 2小时，脱水。缓冲液漂洗20min三. 脱水 常用脱水剂: 乙醇、丙酮 梯度脱水 四.过渡 环氧丙烷:相当于石蜡切片中的透明剂二甲苯。五.浸透和包埋 (一) 浸透利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂。步骤:环氧树脂+无水乙醇(1:1)中12小时环氧树脂24小时(二) 包埋剂环氧树脂

5、:高分子聚合物,单体状态时(聚合前)为液体、能够渗 入组织内;当加入硬化剂和经加温后,聚合成固体包埋剂: 环氧树脂硬化剂: 酸酐类,与环氧树脂起交联作用,并被吸收到树脂链中十二烷基琥珀酸酐(DDSA), 六甲酸酐(MNA), 顺丁烯二酸酐加速剂: 引起环氧树脂末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物,加速包埋剂的凝固速度。2,4,6三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺增塑剂: 使包埋块具有适当的韧性，改善包埋块的切割性能。邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)环氧树脂包埋剂的配方 包埋步骤 1.组织块包埋在环氧树脂包埋模板中，2.置烤箱烘干，3.经45(12小时)、60(3

6、6小时)后，即可聚合硬化，形成包埋块。包埋操作中注意事项 (1)干燥: 所有试剂要防潮, 所用器皿应烘干； (2)搅拌: 配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； (3)包埋时动作轻巧，防止产生气泡； (4)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；药用胶囊：最好用1号(直径6. 3mm)或2号(直径5. 6mm)包埋步骤: a. 取载玻片硬纸盒作为支架，用打孔器在纸盒的盖上钻若干排孔，孔的直径 比胶囊略小。 b. 然后将胶囊插入孔内，胶囊的底部悬空。 c. 打开胶囊盖子，用滴管将包埋剂加入胶囊内至3/4的位置，然后小心地将材 料连同少许包埋混合液移入胶囊内，待材料下沉到胶囊底部后，用一只细 的清洁

7、铜丝调整材料的方位，盖上胶囊盖。 d. 但在加盖之前，必须把盖的圆顶端压凹，这样可以避免空气停留在盖的顶 端，因为氧气会阻碍环氧树脂凝固。 e. 最后将载有胶囊的纸盒放进温箱中，按45 12小时、60 36小时的顺序 升温聚合。参考: 材料的包埋六. 切片(一) 准备工作 1. 修块: 解剖显微镜下, 削去表面的包埋剂, 露出组织;2. 半薄切片定位: 切厚度为1m-10m的切片, 染色, 光学显微镜 观察定位;3. 修整: 定位以后, 对包埋块作进一步的修整。顶端金字塔形, 顶面梯形, 每边长 度0.2mm0.3mm。 半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1)定位: 确定所要观察的范围, 保

8、留观察的部分, 修去其余部分;(2)对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。4. 制刀: 玻璃刀，钻石刀- 制刀机 5载网和支持膜5.1 载网 铜网，圆形、直径3mm。网孔数目100、200、300目等; 5.2 支持膜 聚乙烯醇缩甲醛膜, 载网上覆盖一层, 厚度10nm20nm。 (二) 切片(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)调节 水槽液面高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速度；(6)切片。 (三) 展片当有皱缩的切片浮在槽液时, 用一小块滤纸浸少量氯仿,接近切片, 以这 种蒸气熏之, 使切片展开。 (四) 捞片 将切片捞在有支持膜的载网

9、上。直径3mm七. 染色(电子染色)原 理: 重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附, 电镜观察时重金属 的原子对电子束形成散射, 从而提高图象的反差。常用染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅 染色方法a. 组织块染色: 脱水至70%乙醇, 组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸 铀溶液中, 染色2h以上, 或冰箱中过夜。b. 切 片 染 色: 溶解石蜡制作蜡板,蜡板上滴数滴柠檬酸铅染液, 载网浮在液滴上 (贴有切片的一面朝下),盖上培养皿,染色10-20min. 载网从染液中取出后 ,必须尽快用蒸馏水清洗干净.八. 电镜观察、拍片、记录取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色超薄切片技术步骤过

10、程图 第二节 半薄切片半薄切片法 可供光学显微镜观察研究的塑料切片技术； 制片方法与超薄切片相同，但切片厚度约在0.5-2.0um，介于石蜡切片与超薄切片之间； 效果比石蜡切片好: 较薄，能较好的保存细胞的结构，减少人为假象，比石蜡切片清晰。 常用包埋剂：乙二醇丙烯酸酯(GMA)与环氧树脂一、乙二醇丙烯酸酯(GMA)制片技术1. 水溶性塑料包埋剂-凝固后可被切成0.5-2um的半薄切片 2. 染色时无须去包埋剂3. 可在低温下凝固(紫外光照射) 4. 单体分子渗透性强, 凝固时仅是把结构分子支撑和包围起来, 并不与结构分子形成共价键5. 清晰度高、保存结构完整性好6. 可做组织化学、酶活性和荧

11、光显微观察(一) GMA的性质GMA只有与增塑剂及加速剂混合才能用于制片增塑剂: 控制包埋块硬度 加速剂: 加速包埋剂凝固，也可以控制硬度配方: GMA93g聚乙二醇400(增塑剂)7g过氧化苯酰(加速剂)0.6g(二) GMA包埋剂的配方1. 固定常采用戊二醛和四氧化锇双重固定法 固定方法与超薄切片一样 2. 清洗用0.1M 磷酸缓冲液洗涤3-4次3. 脱水梯度乙醇至100%4. 渗透GMA包埋剂, 0-4下两天以上，换两次。(三) GMA制片过程与超薄切片相似, 经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染 色等步骤。5. 聚合(包埋)用明胶胶囊做模具A. 加热方法: 40 1-2天

12、，60 1天。一般观察。B. 低温聚合: 0 下紫外光照射。做组织化学定位。6. 切片普通切片机、超薄切片机7. 展片切片捞起后放在滴有蒸馏水的载玻片上,在酒精灯上烘烫,待切片完全展开 后,用吸管将水吸走, 烘干切片8. 染色不需要去掉包埋剂。常用甲苯胺蓝-O染色。7. 苯胺蓝(aniline blue)特 点: 酸性染料，染纤维素细胞壁、非染色质结构二、环氧树脂半薄切片技术1. 切片前处理与电子显微镜样品制备相同。2. 切片、粘片与GMA制片方法类似3. 染色一般石蜡切片的染料都可以用 结晶紫，甲苯胺蓝-O经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。三、GMA与环氧树脂半薄切片比较1. GMA的优点: 可以做组织化学定位。缺点: 不能进行电子显微镜观察2. 环氧树脂的优点: 在同一个结构上既可以得到光学显微镜的影像，又可以得到电子显微镜的影像。缺点: 组织化学染色有一定难度。3. 发展趋势: 发展兼有两者优点的包埋剂(L.R.White resin等)