植物组织培养 第五章 植物花药和花粉培养

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1、第五章 植物花药和花粉培养 本章内容提要：一、概念 二、花粉和花药培养技术 三、花粉和花药培养应用1、概念单倍体细胞(haploid cell)：植物的花粉是花粉母细 胞经减数分裂形成的，其染色体数只有体细胞的一半 。花粉和花药的培养(pollen and anther culture)： 指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精 而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技 术。单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使 花粉发育成一个完整的植株。2、花粉和花药培意义 诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种 周期； 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。 获得无病毒个体

2、。3、花药培养发展简史1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成 胚；1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株 ；目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导 成植株。4.花药培养与单倍体育种花药培养的主要目的： 培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为 育种材料的来源。 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基 因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出 有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者 直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。 构建永久性分离群体双单倍体系（Dou

3、bled haploid)，用于基因定位。大大缩短育种周期5、花药培养技术 确定取材时间选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期 和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此 利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确 定花粉发育的准确时期。在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较 为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片 淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定 。水稻花药培养操作过程旗叶鞘用70酒精擦洗一遍剥去旗鞘， 取出稻穗10漂白粉10 min， 无菌水洗一次。70酒精 手洗两遍培养5天后，花药变黑褐色，20天花 药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织

4、 ，先形成芽，后长出根，形成幼苗。用接种环接种 到培养基上左手持穗，右 手用镊子取出 花药，无菌培 养皿中选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝 的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤， 则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二 倍体的愈伤组织。花药培养的条件：光照(1218h，5,00010,000 lx，28)黑暗(12-16h，22)周期交替进行。6、影响花药诱导频率的因素1） 花粉发育时期是影响培养效果的重要因素。在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径 发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育 时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花

5、粉 最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有 丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦) 或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数分裂 中期时更适宜。2）花药供体植株的生长条件对花药培养反 应的影响是很大的。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗 比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提 高。同步化程度高。3） 培养基是花粉启动和再分化的重要条件我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进 ，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率 大幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度较低。随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物 素，研制出C17

6、和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦 的花药出愈率。马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广 泛地应用于小麦花药培养，效果良好。 培养基中的植物生长物质种类会影响花粉发 育的途径 一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L 2,4-D或 NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移 至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质 的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株 形成。 糖种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响。 朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以 0.21 mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖， 小麦花粉胚的诱导频率可增加2-10倍。 一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细

7、胞的生长而对 花粉的生长无妨碍。 烟草的最适蔗糖浓度为3，水稻为3-6，玉米 则为12-15。 在培养基中加入活性炭能促进花药培养4） 低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率以1-5预低温处理小麦幼穗，能提高花粉 愈伤组织的产量。在4下冷冻石刁柏花蕾，预 处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温 对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同。培养温度是影响花药反应的一个重要因素。小麦要求先高温培养64天之后，再转入28-30 下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织 ，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培 养温度仍是减少白化苗的一

8、个有效措施。7、 图示花药培养过程花药材料的选取关键选取处于合适发育期的花 药，离体培养后才能启动花粉发育 。实践表明，从减数分裂期至双核 期的花药，均有可能诱导离体孤雄 发育。大多数园艺植物的花药培养，成 功率最高的时期为单核期，或单核 中晚期。花粉培养过程选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）预培养数天取花药接种分离 花粉v药壁向花粉提供营养物质； v通过药壁吸收、贮存和转化 培养基中的外源物质低温预处理消毒过滤离心再生单倍体植株的二倍化花粉植株染色体可自发加倍；人工措施染色体加倍。传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋 水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96 h。浸泡试管苗方法、处理芽方法、浸根方法花药培养脱毒 1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期 单核期：花蕾4-6mm，花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂 7g/L 增殖培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂 7g/L 生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂 7g/L作业： 1、试论述花药培养的意义。 2、详细论述花药培养方法。