药品分析方法验证

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1、药品分析方法验证张妮 2011.11.25主要内容 n概述n验证的目的n方法验证的一般原则n方法验证涉及的方面n方法验证的具体内容n再验证n对方法验证的评价概 述n 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和 评价应遵循的基本原则，其中，对药品进行质量 控制是保证药品安全有效的基础和前提。为达到 控制质量的目的，需要多角度、多层面来控制药 品质量，也就是说要对药物进行多个项目测试， 来全面考察药品质量。一般地，每一测试项目可 选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠 ，必须对所采用的分析方法的科学性、准确性和 可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试 项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法

2、进 行验证。 n分析方法是揭示药品品质的工具和手段,是 指具体进行分析的方式，应详细描述进行 每个分析试验所必需的步骤。包括但不局 限于：样品、参比对照品、试剂的配制、 仪器的使用、标准曲线的绘制、计算公式 的运用等。n方法验证是判断采用的分析方法是否科学 、可行的过程。验证的目的方法验证就是根据确定的检测项目的要求, 预先设置一定的验证内容,并通过设计合理 的试验来验证所采用的分析方法能否符合 检测项目的要求。在分析方法建立过程中 具有重要的作用，并成为质量研究和质量 控制的组成部分。只有经过验证的分析方 法才能用于控制药品质量，方法验证是制 订质量标准的基础。方法验证是药物研究 过程中的重

3、要内容。方法验证的一般原则n原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进 行方法验证。 n方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合所 采用分析方法的特点确定。 n同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验 证要求。例如，采用高效液相色谱法用于制剂的 鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证 ，前者重点要求验证专属性，而后者重点要求验 证专属性、准确度、定量限。 方法验证涉及的方面n需要验证的检测项目 （目标？）n分析方法（如何实现？）n验证内容 （这样实现可信与否？）需要验证的检测项目n检测项目一般分为鉴别、杂质检查（限度 试验、定量试验）、定量测定（含量测定 、溶出度、释放度等）、其他特定检

4、测项 目等四类。需要验证的检测项目-鉴别n鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合 物，而非其它物质，用于鉴别的分析方法 要求具有较强的专属性。（是与否的界定 ）n常用的鉴别方法有化学法、色谱法（HPLC 、TLC、GC等）、光谱法（IR、UV-Vis等 ）、显微鉴别法等。需要验证的检测项目-杂质n杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质 ，如有机杂质、无机杂质等。n杂质检查可分为限度试验和定量试验两种 情况。n用于限度试验的分析方法验证侧重专属性 和检测限。用于定量试验的分析方法验证 强调专属性、准确度和定量限。 需要验证的检测项目-定量n定量测定包括含量测定、制剂的溶出度测 定等，由于此类项目对准

5、确性要求较高， 故所采用的分析方法要求具有一定的专属 性、准确度和线性。 需要验证的检测项目-其他n其他特定检测项目与上述鉴别、杂质限度 检查及定量试验的情况有所不同，应视具 体情况再具体分析。n举例：如性状、旋光度、pH测定等，一般 就根据药典方法或各品种项下规定测定多 次，主要考察方法的精密度（重复性、重 现性）。分析方法n 分析方法是为完成上述各检测项目而设 定和建立的测试方法，一般包括分析方法 原理、仪器及仪器参数、试剂、系统适用 性试验、供试品溶液制备、对照品溶液制 备、测定、计算及测试结果的报告等。 n 测试方法可采用化学分析方法和仪器分 析方法。这些方法各有特点，同一测试方 法可

6、用于不同的检测项目，但验证内容不 同。 举例n【含量测定】照高效液相色谱法（附录 D）测定。n色谱条件及系统适用性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以四甲基 氢氧化铵溶液（取10%四甲基氢氧化铵溶液20ml，加水880ml，用10% 磷酸溶液ph值至5.4）-乙腈（900：100）作为流动相A；以四甲基氢氧 化铵溶液（取10%四甲基氢氧化铵溶液20ml，加水380ml，用10%磷酸 溶液ph值至5.4）-乙腈（400：600）作为流动相B；检测波长为210nm ，按一定的程序进行梯度洗脱。取脱苏氨醇奥曲肽与醋酸奥曲肽对照 品适量，加水溶解并制成每1ml中各约含脱苏氨醇奥曲肽10g和醋酸 奥曲肽

7、0.1mg的混合溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，理论 板数按奥曲肽峰计算不低于3000；脱苏氨醇奥曲肽峰与奥曲肽峰的分 离度应符合要求。n测定法 取本品5瓶，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml含奥曲肽 0.1mg的溶液，5瓶全量混合，摇匀，作为供试品溶液；精密量取20l 注入液相色谱仪，记录色谱图；另取醋酸奥曲肽对照品适量，同法测 定。按外标法以峰面积计算，即得。验证内容n验证内容包括方法的专属性、线性、范围 、准确度、精密度、检测限、定量限、耐 用性和系统适用性等。 方法验证的具体内容（专属性、线性及范围、准确度、精密度 、检测限、定量限、耐用性及系统适用性 ）专属性n专属性系指在

8、其他成分（如杂质、降解物 、辅料等）可能存在下，采用的分析方法 能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。 n通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中 均应考察其专属性。如采用的方法不够专 属，应采用多个方法予以补充。 1、专属性鉴别反应n 鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明 能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析 物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应， 结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。n 合适的鉴别试验应能区别出可能存在的结构相似的化合物。 可以通过与已知参比物比较，从含有被分析物的样品中得到的 正结果和不含被分析物的样品中得到的负结果来确定

9、。此外， 鉴别试验也可以取与被测物结构相似或相关的物质来试验而得 不到正反应来证实。在考虑可能会造成干扰的前提下，应根据 合理科学的判断来选择可能存在的干扰物。专属性鉴别（色谱法）1.干扰试验（空白溶剂/展开剂、空白辅料） 2.对照 3.样品专属性鉴别（光谱法）n对于光谱法鉴别，专属性主要是考察官能团的特 征吸收峰。专属性鉴别（化学法）n化学反应：n焰色反应：专属性主要关注反应的“特有性”。2.专属性含量测定与杂质检查n 在色谱方法中，应用典型的色谱图来证明专属 性，并在图上恰当地标出每一种成分，其他分离 技术也应如此。n 在色谱方法中，应在一等程度上考察关键性的 分离。对关键性分离，可用两个

10、洗脱程度最接近 的化合物的分离度来证明其专属性。n 当非专属性方法测定含量时，可用其他辅助性 的分析方法来证实整个方法的专属性，如：用滴 定法来测定出厂原料药的含量，可结合使用合适 的杂质检查方法。 n 在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一 定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离（ 分离度大于1.5）和检出（检测限之上），并具适 当的准确度与精密度。 n 对含量测定来说，专属性应包括提供被分析物 在杂质和(或)赋形剂存在时能被区分的证明，实际 操作中可以在纯物质(原料或制剂)中加入一定量的 杂质或辅料，与未加杂质或辅料的样品测定结果 相比较，以证明其含量测定结果不受这些物质的 影响。n

11、对杂质检查来说，通过加入含有一定量杂质的 原料药或制剂，证明各杂质之间能分离，并也能 与样品基质中其他组分分离。举例：杂质可获得情况下n色谱图A:已知杂质1；n色谱图B:已知杂质1+ 空白辅料；n色谱图C:空白辅料；n色谱图D:已知杂质1+ 其他杂质。n 在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性 可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不 同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确 定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、 碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料 的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。 必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行 色谱峰纯度检查。 n 注意进行破坏试验

12、的条件要适度,着重考察敏 感条件,即不能无降解产物产生,也不能将主药成 分破坏殆尽,应以主药成分破坏20% 30%为宜;否 则,无降解产物产生或主药成分破坏殆尽时进行的 专属性试验是不能反映拟定的方法能有效将主药 与杂质分开并能有效检出可能的杂质的。峰纯度的判定n 在色谱中，确认样品色谱图中的色谱峰纯度是 一件困难的事，色谱峰可能存在不止一个化合物 。分析工作者应该知道样品中存在多少化合物， 而这通常是不可能的。因此，应评价目标化合物 色谱峰的纯度。n 过去的做法是改变流动相组成或色谱柱等色谱 参数，而现在是使用与色谱同步的在线光谱检测 器。紫外-可见二极管阵列检测器和质谱仪在整个 色谱图运行

13、期间均能在线采集光谱数据。比较和 洗脱的色谱峰相对应的光谱图，如果光谱图不同 ，说明该色谱峰中至少包含两个化合物。举例1：举例2：n 当共洗脱化合物的光谱图非常 接近时，紫外-可见二极管阵列 检测器就有其局限性，这在代 谢物及其母体化合物时极有可 能发生。这种情况下，最好为 HPLC 配一个质谱检测器。质谱 通常比紫外光谱专属性更强， 因此常用于色谱的选择性评价 。n 一个HPLC 与质谱配合使用 的例子见右图。对于4.86 分钟 洗脱的色谱峰，在不同部位采 集的质谱图不同，显示该色谱 峰不纯。线性及范围n线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被分 析物的浓度（量）直接呈线性关系的程度

14、。n范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性，测试方 法适用的试样中被分析物高低限浓度或量的区间。 线性n 线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目 ，如杂质定量试验和含量测定均需要验证线性。 n 应在设计的测定范围内测定线性关系。可用一 贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系 列被测物质浓度系列进行测定，至少制备5个浓度 。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图 ，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归 。 n 必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性 回归计算，并说明依据。 范围n 范围是规定值，在试验研究开始前应确定 验证的范围和试验方法。可以采用符合要 求的原料药配制成不同的

15、浓度，按照相应 的测定方法进行试验。 n 范围通常用与分析方法的测试结果相同 的单位（如百分浓度）表达。涉及到定量 测定的检测项目均需要对范围进行验证， 如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放 度、杂质定量试验等。 根据剂型和（或）检测项目的要求确定范围n1、含量测定：范围应为测试浓度的80100或更宽。 n2、制剂含量均匀度 ：范围应为测试浓度的70130 。根据剂型特点，如气雾剂、喷雾剂，必要时，范围可适 当放宽。 n3、溶出度或释放度 ：n 对于溶出度，范围应为限度的20；如规定限度 范围为80%，则范围应为60至100。 n 对于释放度，如规定限度范围为，从1小时后为20 至24小时后为

16、90，则验证范围应为0110。 n4、杂质 ：杂质测定时，范围应根据初步实测结果，拟订 出规定限度的20。如果含量测定与杂质检查同时测定 ，用面积归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的-20 至含量限度（或上限）的+20。线性与范围可同时考察n举例：准确度n 准确度系指用该方法测定的结果与真实 值或认可的参考值之间接近的程度。有时 也称真实度。n 应在分析方法规定的范围内建立准确性 。 n 一定的准确度为定量测定的必要条件， 因此涉及到定量测定的检测项目均需要验 证准确度，如含量测定、杂质定量试验等 。 n准确度应在规定的范围内建立，对于制剂 一般以回收率试验来进行验证。试验设计 需考虑在规定范围内，制备3个不同浓度（ 准确度试验浓度应能覆盖整个考虑范围） 的试样，各测定3次，即测定9次，报告已