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1、乳汁中含有人生长激素 的转基因牛(阿根廷)转鱼抗寒基因 的番茄转基因抗虫棉抗虫棉普通棉DNA重组技术的基本工具基因工程的概念基因工程的概念基因工程又叫做基因拼接技术 或DNA重组技术。通俗地说， 就是按照人们的意愿，把一种 生物的某种基因提取出来，加 以修饰改造，然后放到另一种 生物的细胞里，定向地改造生 物的遗传性状。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导
2、入 表达表达基因重组基因重组基因工程的概念基因工程的概念 基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因与与运载体运载体DNADNA拼接拼接导入导入棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) ) 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？ 基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：
3、关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNADNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：基因的基因的剪刀剪刀限制酶限制酶基因的基因的针线针线DNADNA连接酶连接酶基因的基因的运载工具运载工具运载体运载体DNA 重组技术的基本工具本节知识内容1 DNA重组技术的基本工具专题一 基因工程“分子手术刀” 限制酶 “分子缝合针” DNA连接酶 “分子运输车”
4、基因进入受体细胞的载体 识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种特定的核苷酸特定的核苷酸 序列序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定部位特定部位的两的两 个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。主要是从主要是从原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来的一的一 种酶。能将外来的种酶。能将外来的DNADNA切断切断，由于这种，由于这种 切割作用是在切割作用是在DNADNA分子内部进行的，故分子内部进行的，故 名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。40004000种。种。1 1、来源：、来源： 2 2、种类：、种类：3 3、作用：、作用：4 4、结果：、结
5、果：形成两种末端形成两种末端一、一、 “ “分子手术刀分子手术刀” ” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶粘性末端平末端大肠杆菌大肠杆菌( (E.coliE.coli) )的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别 GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在GG和和A A之间切开。之间切开。限制酶限制酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？限制限制 酶酶 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口两条单链的切口 ，带有几个，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好 互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫
6、黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处从识别序列的中心轴线处 切开时，切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是两条单链的切口，是 平整的，这样的切口叫平整的，这样的切口叫平末端平末端。限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4 个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两 侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列 的。图1-1 限制酶识别序列的中心轴线二、二、 “ “分子缝合针分子缝合针” ” DNA DNA连接酶连接酶1、种类：2、作用部位：两类Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNADNA
7、连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“ “ 缝合缝合” ”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起起来，即把梯子两边扶手的断口连接起 来，这样一个重组的来，这样一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。T磷 酸 二 酯 键1234512345ADNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种 ：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为EcoliEcoli 连接酶。另一种是从连接酶。另一种是从T4T4噬菌体中分
8、离得到，称为噬菌体中分离得到，称为 T4T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都 是连接双链是连接双链DNADNA的缺口（的缺口（nicknick），而不能连接单），而不能连接单 链链DNADNA。DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合酶都是形成磷酸聚合酶都是形成磷酸 二酯键（在相邻核苷酸的二酯键（在相邻核苷酸的3 3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5 5 位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么 ，二者的差别主要表现在什么地方呢？，二者的差别主要表现在什么地方呢？ （1 1）DNADNA聚合
9、酶只能将单个核苷酸加到已聚合酶只能将单个核苷酸加到已 有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键； 而而DNADNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNADNA片段之间形成磷片段之间形成磷 酸二酯键，不是在单个核苷酸与酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNADNA片段之片段之 间形成磷酸二酯键。间形成磷酸二酯键。 （2 2）DNADNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNADNA链为模板，链为模板， 将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模 板链互补的板链互补的DNADNA链；而链；而DNADNA连接酶是将连接酶是将DNADNA 双链上的两
10、个缺口同时连接起来。因此双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNADNA 连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。 此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但 组成和性质各不相同。组成和性质各不相同。三、三、 “ “分子运输车分子运输车” ” 基因进入受体细胞的载体：基因进入受体细胞的载体：练习答案2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部 分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各 自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。
11、 细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因 为微生物在长期的进化过程中形成了一套完 善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降 解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限 制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种 限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶 将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制 酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某 种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且 可以防止外源DNA的入侵 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid） ，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双 链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载 体使用呢？其实不然
12、，作为基因工程使用的载体必需满足以下条 件。 （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的 基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点 所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才 不至于因目的基因的插入而失活。 （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛 选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进 入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作， 太大就不便
13、操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进 行人工改造后才能用于基因工程操作。课本知识回顾基因工程又叫做 或 。通俗地说， 就是按照人们的意愿，把一种生 物的某种 提取出来，加以 ，然后放到另一种生 物的细胞里， 改造生物 的遗传性状。基因拼接技术DNA重组技术基因修饰改造定向地DNA 重组技术的基本工具“分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车”限制酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 主要是从主要是从 的一种酶。的一种酶。 识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种 ， 并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间 的的 断开。断开。 形成两种末端形成两种末端原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列磷酸二酯键粘性末端平末端二、二、 “ “分子缝合针分子缝合针” ” DNA DNA连接酶连接酶1、种类：2、作用部位：两类Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶磷酸二酯键基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体通常有三种:在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒 都是在 基础上进行过 的质粒噬菌体衍生物动植物病毒天然质粒人工改造
